羧甲基纖維素/海藻酸鈉干細(xì)胞微囊及其制備和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微囊化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種簇甲基纖維素/海藻酸鋼干 細(xì)胞微囊及其制備和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微膠囊本身是一種把分散的固體物質(zhì)、液滴或氣體包封在一層致密膜中形成的包 覆體復(fù)合結(jié)構(gòu)，用于包覆的致密膜通常是由天然或合成高分子材料制成。由于其具有上述 包覆的微囊按結(jié)構(gòu)，其功能應(yīng)用中可W將酶、輔酶、蛋白質(zhì)等生物大分子或動(dòng)植物細(xì)胞包圍 在珠狀的微囊里，而小分子的物質(zhì)、培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)可W自由出入半透膜，達(dá)到便于催化 或培養(yǎng)的目的，所W微囊經(jīng)常被用于細(xì)胞Ξ維培養(yǎng)，即微囊化細(xì)胞培養(yǎng)。
[0003] 微囊化細(xì)胞培養(yǎng)中采用微囊的親水性半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不 會(huì)溢出同時(shí)小分子物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)可W自由出入半透膜；囊內(nèi)用作為細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，與 液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故相比其他的微珠載體、支架等常規(guī)的Ξ維培養(yǎng)方式 細(xì)胞生長好、密度高。
[0004]目前微囊化細(xì)胞培養(yǎng)中，包膜材料最通常采用的是海藻酸鋼/聚賴氨酸微膠囊； 其中，海藻酸鋼是屬于從海洋的褐藻中提取的直鏈陰離子多糖，具有良好的生物相容性，并 且其分子結(jié)構(gòu)孔隙和穩(wěn)定性都比較好，所W其在具有力學(xué)骨架長期穩(wěn)定優(yōu)勢的條件下，非 常適合于被用作微囊的半透膜骨架，既具有良好的生物相容性，又能保持良好的通透性。聚 賴氨酸是人工合成的陽離子聚合物，在水相中與陰離子海藻酸鋼混合時(shí)，兩者的陰、陽離子 發(fā)生快速反應(yīng)交聯(lián)成厚約20~100μm半透膜的微膠囊。
[0005] 但是，上述海藻酸鋼/聚賴氨酸微膠囊在用作為藥物緩釋、祀向釋放控制、或者是 一些活性成分保護(hù)中，基本上能較好地滿足使用的要求。但是在作為干細(xì)胞培養(yǎng)載體使用 時(shí)，海藻酸鋼與聚賴氨酸之間的陰、陽離子化學(xué)結(jié)合，易被培養(yǎng)液成分破壞而導(dǎo)致包膜破 碎，并且還容易引起微囊周纖維化反應(yīng)。因此微囊內(nèi)不能形成較好的細(xì)胞生長環(huán)境，細(xì)胞培 養(yǎng)擴(kuò)增效率較低、形成的凝膠珠硬度較高，不利于干細(xì)胞的培養(yǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明實(shí)施的目的在于克服現(xiàn)有海藻酸鋼/聚賴氨酸微膠囊的缺陷，提供一種簇 甲基纖維素/海藻酸鋼干細(xì)胞微囊及其制備和培養(yǎng)方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種簇甲基纖維素/海藻酸鋼干細(xì)胞微囊的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 獲取簇甲基纖維素和海藻酸鋼；
[0010] 將所述海藻酸鋼于水中分散后，再加入待培養(yǎng)的干細(xì)胞，制成海藻酸鋼和干細(xì)胞 的混合懸液；
[0011] 將所述簇甲基纖維素用體積分?jǐn)?shù)1~2%的醋酸分散，制成簇甲基纖維素溶液；
[0012] 將所述混合懸液加入至簇甲基纖維素溶液中進(jìn)行凝聚。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步還提出采用上述方法直接制備得到的簇甲基纖維素/海藻酸鋼干 細(xì)胞微囊。
[0014] 同時(shí)，還提出用上述微囊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的方法，方法過程包括：將簇甲基纖維素/ 海藻酸鋼干細(xì)胞微囊于培養(yǎng)容器中進(jìn)行大量培養(yǎng)。
[0015] 本發(fā)明制備的微囊相比通常的聚賴氨酸/海藻酸鋼細(xì)胞培養(yǎng)微囊，其包膜結(jié)構(gòu)為 簇甲基纖維素和海藻酸鋼形成的半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成的膜結(jié)構(gòu)具有良好的溶脹、縮脹等 性能，用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)其透性和穩(wěn)定性上更好一些，能形成較好的細(xì)胞生長環(huán)境，提升細(xì)胞 培養(yǎng)擴(kuò)增的效率。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0017] 本發(fā)明實(shí)例提出一種簇甲基纖維素/海藻酸鋼干細(xì)胞微囊的制備方法，步驟包 括：
[0018] S10,獲取簇甲基纖維素和海藻酸鋼；
[0019] S20,將海藻酸鋼于水中分散后，再加入待培養(yǎng)的干細(xì)胞，制成海藻酸鋼和細(xì)胞的 混合懸液；
[0020] S30,將簇甲基纖維素用1~2%的醋酸分散，制成簇甲基纖維素溶液；
[0021] S40,將海藻酸鋼和細(xì)胞的混合懸液加入至簇甲基纖維素溶液中，待凝聚后獲取微 。
[0022] 本發(fā)明中，采用簇甲基纖維素作為與海藻酸鋼交聯(lián)的形成包膜材料，簇甲基纖維 素是纖維素酸化（簇甲基化反應(yīng)是酸化技術(shù)的一種）之后形成的陰離子型纖維素酸，具有 較高的取代度和取代均勻度；相比聚賴氨酸/海藻酸鋼并不是陰、陽離子結(jié)合的方式成膜， 當(dāng)簇甲基纖維素混入海藻酸鋼溶液中時(shí)，海藻酸鋼的線性分子鏈會(huì)貫穿于簇甲基纖維素分 子網(wǎng)中，構(gòu)成交聯(lián)的半網(wǎng)絡(luò)互穿結(jié)構(gòu)。其形成一方面是因?yàn)槎际顷庪x子聚合，所W不存在 陰、陽離子的化學(xué)共價(jià)鍵合。形成半互穿網(wǎng)絡(luò)之后，簇甲基纖維素與海藻酸鋼兩者形成的膜 結(jié)構(gòu)具有良好的溶脹、縮脹等性能，用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)其透性和穩(wěn)定性上更好一些，能形成較 好的細(xì)胞生長環(huán)境，提升細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的效率。
[0023] 本案的上述干細(xì)胞培養(yǎng)微膠囊的制備方法中，微膠囊的形成采用的滴加的方式， 將海藻酸鋼和細(xì)胞的混合液滴加至簇甲基纖維素溶液中；因?yàn)檫\(yùn)兩者本身是屬于纖維共混 的方式成膜，但是運(yùn)兩種高分子材料是具有相容性的。其中比較公知的是，采用運(yùn)兩者材料 制備紡絲液的結(jié)果中，簇甲基纖維素鋼含量在5~15% (w/v)范圍內(nèi)時(shí)，簇甲基纖維素鋼與 海藻酸鋼是相容的，超出運(yùn)個(gè)范圍則是不相容的；所W制備紡絲液時(shí)，簇甲基纖維素鋼的含 量不能超過20% (w/v)。
[0024] 在上述情形下本案經(jīng)過考量和實(shí)施，簇甲基纖維素溶液中帶有醋酸呈酸性，所W將細(xì)胞與海藻酸鋼混合之后加入至簇甲基纖維素中，此時(shí)交聯(lián)環(huán)境簇甲基纖維素的濃度比 肯定遠(yuǎn)超出上述相容濃度范圍，所W比較滿足不相容的濃度范圍，并促進(jìn)凝結(jié)形成包膜。同 時(shí)，本案中細(xì)胞與海藻酸鋼的混合懸液加入的方式，采用滴加或注射的方式進(jìn)行，避免直接 大量共混造成無法在表面上均勻成膜。
[00巧]同時(shí)，進(jìn)一步為了保證形成微囊之后，細(xì)胞能具有相對(duì)比較適合的生長和擴(kuò)增的 能力，步驟S20懸液的配置中優(yōu)選細(xì)胞與海藻酸鋼的混合懸液中干細(xì)胞的濃度控制0. 5~ 2X107個(gè)/mL。微囊內(nèi)包覆的細(xì)胞密度過低，在培養(yǎng)的過程中比較難W快速生長增殖；而如 果過高，本身微囊內(nèi)的空間有限，細(xì)胞之間的空間和養(yǎng)料競爭加劇，位置處于競爭性劣勢的 細(xì)胞一旦出現(xiàn)調(diào)亡，也會(huì)誘發(fā)其他正常細(xì)胞的調(diào)亡，所W盡量使微囊內(nèi)的細(xì)胞處于比較適 合的濃度范圍，空間和養(yǎng)料獲取都處于比較均一的程度，更利于細(xì)胞的培養(yǎng)。
[00%] 進(jìn)一步出于形成包膜的品質(zhì)，如果步驟S40中采用注射的方式將干細(xì)胞與海藻酸 鋼的混合懸液加入至簇甲基纖維素中，那么注射的速率控制2~8ml/min，因?yàn)樽⑸涞目炻?都會(huì)影響表面包膜形成的品質(zhì)和穩(wěn)定性。并且，出于上述兩者在不相容下形成微囊品質(zhì)的 立意，干細(xì)胞與海藻酸鋼的混合懸液中，海藻酸鋼的質(zhì)量體積濃度為0. 5~2% ;對(duì)應(yīng)步驟 S30配置簇甲基纖維素的醋酸溶液中，簇甲基纖維素濃度為0.5~2% (w/v)。注射的過程 中，盡量保證針頭位置始終與裝簇甲基纖維素的容器口持平，使細(xì)胞懸液勻速滴入。待反應(yīng) lOmin后，注射滴入的懸液表面即交聯(lián)形成了微囊。
[0027] 并且，進(jìn)一步在步驟S30配置簇甲基纖維素的醋酸溶液中，還可W向溶液中添加 化C1，至其濃度為0. 05~0. 3mol/L;因?yàn)殡x子強(qiáng)度也會(huì)影響復(fù)凝聚的速率和效果，經(jīng)過反 復(fù)的測量其復(fù)凝聚的品質(zhì)和效率，在實(shí)施的過程中加入〇.〇5mol/l、0.lmol/l、0. 2mol/l、 0.3111〇1/1的化(：1制備的微囊復(fù)凝物的產(chǎn)率分別是94.46%、95.33%、94.81%和83.27%。 從凝聚產(chǎn)率的結(jié)果可W看出離子強(qiáng)度在化Cl濃度處于0.Imol/L左右的情況下較好，至U 0.3mol/L及其W上時(shí)，凝聚的生成率和品質(zhì)相對(duì)有下降。
[0028]同時(shí)在上述實(shí)施的過程中，步驟S40制備獲得微囊之后，需要進(jìn)一步對(duì)微囊進(jìn)行 洗涂，洗涂可W依次采用質(zhì)量體積濃度0. 3~0. 9%的生理鹽水2~3次左右后、再用不含 FBS(已W避免細(xì)胞因子導(dǎo)致干細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)或者性狀分化）的α-MEM培養(yǎng)基洗涂2~3 次即可。
[0029] 并且在實(shí)施中，步驟S20~步驟S40盡量流楊快速的完成，因?yàn)榇囵B(yǎng)的干細(xì)胞 是活細(xì)胞，如果操作時(shí)間過長，細(xì)胞在沒有營養(yǎng)的環(huán)境中比較容易出現(xiàn)調(diào)亡；所W上述采用 α-MEM培養(yǎng)基的洗涂一方面可W增加微囊縮脹適應(yīng)性，還可W提供細(xì)胞代謝營養(yǎng)，避免細(xì) 胞衰退。同時(shí)步驟S40制備完成微囊之后，應(yīng)當(dāng)建議直接進(jìn)行培養(yǎng)，表面存放中導(dǎo)致細(xì)胞死 亡。即使要進(jìn)行保存，也應(yīng)當(dāng)在能維持細(xì)胞營養(yǎng)和活性的保存液中進(jìn)行。
[0030] 基于本發(fā)明上述制備方法過程，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種采用上述簇甲基纖維素 /海藻酸鋼干細(xì)胞微囊的制備方法得到的微囊，該微囊相比通常的聚賴氨酸/海藻酸鋼細(xì) 胞培養(yǎng)微囊，其包膜結(jié)構(gòu)為簇甲基纖維素和海藻酸鋼形成的半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，形成的膜結(jié) 構(gòu)具有良好的溶脹、縮脹等性能，用于細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)其透性和穩(wěn)定性上更好一些，能形成較好 的細(xì)胞生長環(huán)境，提升細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的效率。
[0031] 在上述基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步提出上述微囊的培養(yǎng)方法，具體實(shí)施的過程中，將上 述制備的簇甲基纖維素/海藻酸鋼干細(xì)胞微囊接種于培養(yǎng)容器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)即可。
[0032] 但是，進(jìn)一步在培養(yǎng)的過程中，每周全量換液3次（細(xì)胞被固定在包囊內(nèi)，可W進(jìn) 行全量換液）、半量換液1次，培養(yǎng)28天。
[0033] 一般通常的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)箱的條件為37 °C、5 %C〇2動(dòng)物細(xì)胞培 養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。而本案中經(jīng)過對(duì)比，相比未用微囊包覆的干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，正常培養(yǎng)過程中 微囊包覆的細(xì)胞的代謝能力略顯不足；因?yàn)槲⒛野仓?，雖然形成微囊的包膜具有孔隙 和半透性，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分基本上能被干細(xì)胞所獲取，但是微囊內(nèi)細(xì)胞的氧獲取能力 降低，影響了細(xì)胞的有氧代謝。在缺氧狀態(tài)下，ATP合成減少，細(xì)胞的功能和完整性極易受 損。而缺氧時(shí)細(xì)胞獲取ATP的主要途徑是糖的無氧酵解，采用培養(yǎng)基中的通常的葡萄糖等 有氧代謝能源底物，細(xì)胞的生長會(huì)能力稍微不足。所W可W采用在培養(yǎng)基中添加補(bǔ)充果糖 進(jìn)行，因?yàn)楣鞘侨毖鯛顟B(tài)下肝細(xì)胞獲能的有效糖酵解物質(zhì)，能在缺氧狀態(tài)下提供ATP，維 持細(xì)胞膜的離子累，所W能有效的保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整性和細(xì)胞的功能，果糖能提供大量 的F-1-P(l-憐酸