一種快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]病原物是能夠引起植物或者動(dòng)物病害的生命體的統(tǒng)稱。但是，目前對(duì)于病原生物的診斷方法單一、效率低、特異性較差。所以，建立病原生物尤其是新變異的病原物的特異性檢測(cè)靶標(biāo)的篩選是快速、高效實(shí)現(xiàn)病原物的診斷和防治的基礎(chǔ)。
[0003]對(duì)于家蠶微粒子病的檢測(cè)可以追溯到1870年，巴斯德創(chuàng)立了母蛾鏡檢法檢測(cè)家蠶微孢子，100多年來(lái)，此方法一直沿用至今，是生產(chǎn)上用于檢測(cè)的傳統(tǒng)方法。但是該方法較為復(fù)雜、對(duì)于操作者經(jīng)驗(yàn)要求較強(qiáng)，并且不同人操作存在誤差較大。因此，目前對(duì)于該病的檢測(cè)研究熱點(diǎn)主要集中在尋找一種更簡(jiǎn)單、更快速的檢測(cè)方法。到目前為止家蠶微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)經(jīng)歷了以下幾個(gè)階段:顯微鏡檢、分子生物學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)。近年來(lái)，逐步還發(fā)展了其針對(duì)微孢子蟲(chóng)種間孢壁蛋白抗原性的不同而開(kāi)展的一系列免疫學(xué)檢測(cè)方法。但是，由于免疫學(xué)檢測(cè)方法的確立試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)成本較大，因此，在一定程度上制約了該法的推廣應(yīng)用。不過(guò)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，2004年家蠶微孢子蟲(chóng)全基因組測(cè)序完成，并繪制了框架圖，微粒子病的檢測(cè)開(kāi)始進(jìn)入了分子生物學(xué)階段，利用PCR技術(shù)或LAMP技術(shù)檢測(cè)微粒子病的方法始見(jiàn)報(bào)道。盡快PCR檢測(cè)試劑盒存在研究周期較短、投入成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，但是，由于現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有一種統(tǒng)一的靶基因確定辦法，因此，目前市場(chǎng)上現(xiàn)存的PCR檢測(cè)試劑盒存在靈敏度、特異性較差的問(wèn)題。那么，盡快建立一種特異性較好、針對(duì)性較強(qiáng)的靶基因檢索方法就成為微粒子病檢測(cè)工作的重中之重。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是為解決目前對(duì)于病原生物的診斷方法單一、效率低、特異性較差的難題，提供一種快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法。
[0005]本發(fā)明提供一種快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法，包括以下步驟:
[0006]采集新型病原生物的樣本，提取其基因組，構(gòu)建基因組文庫(kù)；
[0007]通過(guò)NCBI的已發(fā)布的基因組信息，基于看家基因座位的保守性，進(jìn)行染色體或者scaffold逐一對(duì)齊，同時(shí)進(jìn)行共線性分析；
[0008]檢索出基因座位不保守的基因，并且通過(guò)比較基因組學(xué)分析確定其與GenBank庫(kù)中不具有同源的基因序列作為候選基因；
[0009]將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫(kù)；
[0010]對(duì)候選基因進(jìn)行克隆、測(cè)序、比對(duì)分析，并檢測(cè)基因的表達(dá)情況；
[0011]將驗(yàn)證正確，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄的基因確定為分子診斷的靶基因；
[0012]收集多種形態(tài)各異的具有同一寄主的病原微生物，并將候選基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。
[0013]進(jìn)一步的，將特異性好的靶標(biāo)基因制成PCR快速檢測(cè)試劑盒，或者制成免疫檢測(cè)試劑盒。
[0014]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法在基因組水平快速查找新型病原生物的物種特異基因，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)建立新型病原物的特異性分子診斷，適用于突發(fā)疫病、新型變異病原物等病理學(xué)特征未知、傳播途徑未知等人們研究不深入的病原物的快速檢測(cè)與診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1所示為本發(fā)明實(shí)施例中32號(hào)Scaffold上的一端特異基因組區(qū)域的共線性分析圖。
[0016]圖2所示為本發(fā)明實(shí)施例中NbPolk和NbOPI兩個(gè)編碼基因的RT-PCR驗(yàn)證圖。
[0017]圖3所示為本發(fā)明實(shí)施例中六種家蠶病原微生物分離株的PCR檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下文將結(jié)合具體附圖詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。
[0019]實(shí)施例
[0020]本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法，包括以下步驟:
[0021]采集新型病原生物的樣本，提取其基因組，構(gòu)建基因組文庫(kù)；
[0022]通過(guò)NCBI的已發(fā)布的基因組信息，基于看家基因座位的保守性，進(jìn)行染色體或者scaffold逐一對(duì)齊，同時(shí)進(jìn)行共線性分析；
[0023]檢索出基因座位不保守的基因，并且通過(guò)比較基因組學(xué)分析確定其與GenBank庫(kù)中不具有同源的基因序列作為候選基因；
[0024]將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫(kù)；
[0025]對(duì)候選基因進(jìn)行克隆、測(cè)序、比對(duì)分析，并檢測(cè)基因的表達(dá)情況；
[0026]將驗(yàn)證正確，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄的基因確定為分子診斷的靶基因；
[0027]收集多種形態(tài)各異的具有同一寄主的病原微生物，并將候選基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。
[0028]進(jìn)一步的，將特異性好的靶標(biāo)基因制成PCR快速檢測(cè)試劑盒，或者制成免疫檢測(cè)試劑盒。
[0029]目前，該發(fā)明已應(yīng)用于家蠶微粒子病的病原檢測(cè)上。
[0030]具體實(shí)施舉例:
[0031]分離采集重慶地區(qū)的家蠶微粒子病蠶，提取其total RNA，并進(jìn)行全基因組測(cè)序。此后，對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosema bombycis CQ1)全基因組4，479個(gè)基因進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，通過(guò)與其他已發(fā)布的其他微孢子蟲(chóng)基因組信息，包括Encephalitozoonromaleae，Encephalitozoon intestinalis，Encephalitozoon hellem，Encephalitozoonbieneusi，Nosema cerannae，Vittaforma corneae，Edhazardia aedis，Antonosporalocustae，Vavraia culicis floridiensis，Trichomonas hominis，Nematocida spl 等從人、貓、兔、蜜蜂、按蚊、果蠅等寄主中分離得到的微孢子蟲(chóng)逐一比較，獲得了 82個(gè)家蠶微孢子蟲(chóng)孤兒基因(orphan gene)，為家蠶微孢子蟲(chóng)獨(dú)有，并且在GenBank中不存在同源序列及基因家族信息。
[0032]如圖1所示，對(duì)NCBI能夠檢索到的近緣物種，于GenBank中下載其基因組序列，左側(cè)為六種已知基因組數(shù)據(jù)的微孢子蟲(chóng)進(jìn)化關(guān)系，右側(cè)為案例中通過(guò)共線性分析得到的感染家蠶的病原微生物特異的靶標(biāo)基因。其中每一列為同源基因及其在基因組中的座位，橫線表示基因組拼接情況及基因間隔距離。將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫(kù)；密碼子偏好性顯示，這些基因傾向使用UCG(Ser)和CCG(Pro)兩類密碼子。通過(guò)對(duì)這82個(gè)基因所在scaffold的GC分布特征調(diào)查，結(jié)果篩選到4個(gè)為新近插入基因，對(duì)這四個(gè)基因進(jìn)行Gene Ontology (GO)功能分類顯示，他們主要參與DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡通路的功能基因，將這類基因單獨(dú)建庫(kù)。
[0033]分別設(shè)計(jì)候選基因的上下游特異引物，進(jìn)行T克隆，并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果匹配度^ 98%的基因作為候選。同時(shí)，以家蠶微粒子病蠶total RNA為模板進(jìn)行候選基因的表達(dá)情況分析，并確定其轉(zhuǎn)錄時(shí)期，將感病中后期穩(wěn)定表達(dá)的基因作為候選靶標(biāo)基因。
[0034]如圖2所示，分別提取病蠶幼蟲(chóng)期1-10天，成蟲(chóng)期(因其為變態(tài)發(fā)育，故分別取蛹、蛾、卵時(shí)期)的total RNA，取前面分析得到的候選基因的特異引物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，結(jié)果顯示，分別與家蠶、病原物的對(duì)照相比，這兩個(gè)基因均在感染后持續(xù)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，適合作為候選靶標(biāo)基因。后經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證完全匹配，故將驗(yàn)證正確的候選基因單獨(dú)艱苦，并確定為分子診斷的靶基因。
[0035]如圖3所示，選用患6種不同病的家蠶為模板，利用候選基因庫(kù)中的靶標(biāo)基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示GENE 1、gene I1、gene IV特異性最好，可以組裝試劑盒。
[0036]目前，將其進(jìn)行家蠶微粒子病LAMP檢測(cè)試劑盒制備，其中Genel和GenelV特異性較好，靈敏度達(dá)1 X 105個(gè)病原物。
[0037]本發(fā)明是基于對(duì)一種感染家蠶的病原微生物——家蠶微孢子蟲(chóng)為研究對(duì)象獲得的一種可推廣、應(yīng)用性強(qiáng)的研究方法。
[0038]此外，該法確立后，對(duì)于解決已完成基因組測(cè)序的未知病原物、或者快速變異的病原微生物的快速檢測(cè)提供了一種行之有效的方法。
[0039]本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法在基因組水平快速查找新型病原生物的物種特異基因，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)建立新型病原物的特異地分子診斷，適用于突發(fā)疫病、新型變異病原物等病理學(xué)特征未知、傳播途徑未知等人們研究不深入的病原物的快速檢測(cè)與診斷。
[0040]本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本文的實(shí)施例進(jìn)行改變。上述實(shí)施例只是示例性的，不應(yīng)以本文的實(shí)施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法，其特征在于，包括以下步驟: 采集新型病原生物的樣本，提取其基因組，構(gòu)建基因組文庫(kù)； 通過(guò)NCBI的已發(fā)布的基因組信息，基于看家基因座位的保守性，進(jìn)行染色體或者scaffold逐一對(duì)齊，同時(shí)進(jìn)行共線性分析； 檢索出基因座位不保守的基因，并且通過(guò)比較基因組學(xué)分析確定其與GenBank庫(kù)中不具有同源的基因序列作為候選基因； 將候選基因在目的病原物基因組數(shù)據(jù)中進(jìn)行檢索，確定其上下游基因保守性，并單獨(dú)建庫(kù)； 對(duì)候選基因進(jìn)行克隆、測(cè)序、比對(duì)分析，并檢測(cè)基因的表達(dá)情況； 將驗(yàn)證正確，并且能夠正常轉(zhuǎn)錄的基因確定為分子診斷的靶基因； 收集多種形態(tài)各異的具有同一寄主的病原微生物，并將候選基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。2.如權(quán)利要求1所述的快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法，其特征在于，還包括將靶基因制成PCR快速檢測(cè)試劑盒或免疫檢測(cè)試劑盒的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法。本發(fā)明的快速檢索病原物特異性檢測(cè)靶標(biāo)的方法在基因組水平快速查找新型病原生物的物種特異基因，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)建立病新型原物的特異地分子診斷，適用于突發(fā)疫病、新型變異病原物等病理學(xué)特征未知、傳播途徑未知等人們研究不深入的病原物的快速檢測(cè)與診斷。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105255998
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510341295
【發(fā)明人】周澤揚(yáng), 羅潔, 潘國(guó)慶, 杜孝田
【申請(qǐng)人】西南大學(xué), 重慶文理學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年6月18日