快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的ss-pcr特異性引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的SS-PCR特異性引物 及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘤腔實(shí)繩Bactroceratuberculata(Bezzi)是一種重要的入侵檢疫性害蟲，屬雙 翅目Diptera實(shí)繩科Tephritidae果實(shí)繩屬Bactrocera果實(shí)繩亞屬Bactrocera。目前主 要分布在老撾、緬甸、不丹、中國的云南。由于國際貿(mào)易的日漸頻繁，合作領(lǐng)域不斷拓寬，在 進(jìn)出境的果蔬中經(jīng)常截獲各種不同的實(shí)蠅幼蟲、卵或蛹，甚至為頭、胸、翅、足等殘體；對于 幼蟲的分類鑒定要比成蟲困難得多，為了保證鑒定的準(zhǔn)確性通常是將幼蟲在室內(nèi)飼養(yǎng)為成 蟲，而這需要花費(fèi)較長的時間，嚴(yán)重影響了果蔬進(jìn)出口貿(mào)易的通關(guān)速度；而對于殘體則是無 法對其進(jìn)行正確的識別。因此為了防止檢疫性實(shí)蠅傳入以及擴(kuò)散，迫切需要開展關(guān)于實(shí)蠅 的快速鑒定識別的技術(shù)。
[0003] 近年來，由于分子生物學(xué)技術(shù)能解決傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以解決的問題 且不受蟲態(tài)的影響，越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)被運(yùn)用于昆蟲的鑒定中，種特異引物 PCR(Species-specificPCR，SS_PCR)技術(shù)，即在設(shè)計目標(biāo)物種的引物時必須充分考慮引物 的特異性，使得在擴(kuò)增未知模板時能夠根據(jù)目標(biāo)片段條帶的有無就能把目標(biāo)種類與其他種 類鑒別開來。本發(fā)明提供了一種采用特異性引物快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的方法，能夠準(zhǔn)確及時 對截獲的疑似瘤脛實(shí)蠅的卵、蛹、幼蟲、成蟲及殘體等進(jìn)行鑒定，建立了一種快速鑒定瘤脛 實(shí)蠅的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的SS-PCR特異性引物。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明的再一目的是提供快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的方法。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的快速鑒定銹實(shí)蠅的SS-PCR特異性引物，引物序列為：
[0008] LJF400:5' -ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3' ；
[0009]LJR564:5 ' -CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3 '。
[0010] 選擇番石植實(shí)繩B.correcta，、桔小實(shí)繩B.dorsalis、顏帶實(shí)繩B.cilifer、銹實(shí) 繩B.rubigina、瘤腔實(shí)繩B.tuberculata、楊桃實(shí)繩B.carambolae、瓜實(shí)繩B.cucurbitae、 辣椒實(shí)繩B.latifrons、南瓜實(shí)繩B.tau、具條實(shí)繩B.scutellata、近黑顏實(shí)繩B.parater、 黑膝實(shí)繩B.scutellaris、何氏華實(shí)繩B.hochii、率實(shí)繩Carpomyavesuviana、瓜棍腹實(shí)繩 Dacuslongicornis、腿端黑實(shí)繩B.atrifemur、黑顏實(shí)繩B.diaphora作為陰性對照來證明 本發(fā)明設(shè)計的引物的特異性，大大縮短了銹實(shí)蠅的鑒定周期。
[0011] 上述引物對擴(kuò)增得到的鑒定瘤脛實(shí)蠅的特異性片段的序列為：
[0012] 5 '-ACTCCACTTAGCCGGGATCTCCTCAATTTTAGGGGCAGTTAATTTCATTACAACAGTAATTAAT ATGCGATCAACAGGGATTTCTTTTGACCGAATACCACTTTTCGTTTGAGCAGTTGTATTAACGGCCTTATTACTT TTATTGTCTCTGCCAGTTTTAGCCGG-3 '
[0013] 本發(fā)明具體提供了一種采用特異性引物快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的方法，具體方法如 下：
[0014](1)通過種特異引物PCR(SS-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，篩選出了1對瘤脛實(shí)蠅 的特異性引物L(fēng)JF400 :5' -ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3'；
[0015]LJR564:5 ' -CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3 '。
[0016](2)采用SSR-PCR引物的種特異性的檢驗：選用番石植實(shí)繩B. correcta，、桔小實(shí) 繩B. dorsalis、顏帶實(shí)繩B. cilifer、銹實(shí)繩B. rubigina、瘤腔實(shí)繩B. tuberculata、楊桃實(shí) 繩B. carambolae、瓜實(shí)繩B. cucurbitae、辣椒實(shí)繩B. latifrons、南瓜實(shí)繩B. tau、具條實(shí)繩 B. scutellata、近黑顏實(shí)繩B. parater、黑膝實(shí)繩B. scutellaris、何氏華實(shí)繩B. hochii、率 實(shí)繩Carpomya vesuviana、瓜棍腹實(shí)繩Dacus longicornis、腿端黑實(shí)繩B. atrifemur、黑 顏實(shí)蠅B. diaphora作為陰性對照，瘤脛實(shí)蠅為陽性對照，驗證銹實(shí)蠅特異性引物的種特異 性。結(jié)果表明，僅銹實(shí)蠅在165bp處有一條特異性擴(kuò)增的條帶，陰性對照均無特異性目標(biāo)片 段，從而證明該引物在實(shí)驗涉及的這些實(shí)蠅種類范圍內(nèi)，能特異性的鑒定瘤脛實(shí)蠅。
[0017] 一方面，引物的特異性是本實(shí)驗成功的關(guān)鍵，特異性片段要有足夠變異能夠?qū)⒉?同物種區(qū)分開。另一方面，當(dāng)口岸僅發(fā)現(xiàn)卵或是殘體時，即只能提取到微量DNA時，SS-PCR 檢測鑒定方法的靈敏度就至關(guān)重要了。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案具有較高的靈敏度，能檢測 到的DNA模板濃度可低至5. 597ng/uL，同時該SS-PCR特異性引物能夠穩(wěn)定區(qū)分近似物種， 因此，本發(fā)明的檢測鑒定方法在實(shí)際檢疫工作中也得到應(yīng)用和驗證。
[0018] 綜上所述，本發(fā)明所建立的SS-PCR快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的方法具有快速簡便、特異 性尚、靈敏度尚等優(yōu)點(diǎn)，可以在8小時之內(nèi)完成鎊實(shí)繩的鑒定，能夠滿足口岸檢驗檢疫快速 通關(guān)的要求。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示利用通用型引物L(fēng)C01490和HC02198對提取的實(shí)蠅DNA模板進(jìn)行質(zhì)量 檢測的結(jié)果，（M:50bpDNALadder，l:番石植實(shí)繩B.correcta，2:桔小實(shí)繩B.dorsalis， 3 :顏帶實(shí)繩B.cilifer，4 :銹實(shí)繩B.rubigina，5 :瘤腔實(shí)繩B.tuberculata，6 :楊桃實(shí)繩 B.carambolae，7 :瓜實(shí)繩B.cucurbitae，8 :辣椒實(shí)繩B.latifrons，9 :南瓜實(shí)繩B.tau，10 : 具條實(shí)繩B.scutellata，11 :近黑顏實(shí)繩B.parater，12 :黑膝實(shí)繩B.scutellaris，13 :何 氏華實(shí)繩B.hochii，14 :率實(shí)繩Carpomyavesuviana，15 :瓜棍腹實(shí)繩Dacuslongicornis， 16 :腿端黑實(shí)繩B.atrifemur，17 :黑顏實(shí)繩B.diaphora，18 :空白對照ddH20。
[0020] 圖2引物L(fēng)JF400和LJR564的種特異性驗證，M:IOObpDNALadder，1 :瘤脛 實(shí)繩B.tuberculata，2 :番石植實(shí)繩B.correcta，3 :桔小實(shí)繩B.dorsalis，4 :顏帶實(shí)繩 B.cilifer，5 :銹實(shí)繩B.rubigina，6 :楊桃實(shí)繩B.carambolae，7 :瓜實(shí)繩B.cucurbitae， 8 :辣椒實(shí)繩B.latifrons，9 :南瓜實(shí)繩B.tau，10 :具條實(shí)繩B.scutellata，11 :近黑顏實(shí)繩 B.parater，12 :黑膝實(shí)繩B.scutellaris，13 :何氏華實(shí)繩B.hochii，14 :率實(shí)繩Carpomya vesuviana，15 :瓜棍腹實(shí)繩Dacuslongicornis，16 :腿端黑實(shí)繩B.atrifemur，17 :黑顏實(shí) 繩B.diaphora，18 :空白對照ddH20。
[0021] 圖 3 引物L(fēng)JF400 和LJR564 的靈敏度驗證，M:100bpDNALadder，I:10°，2 :10 \ 3 :10 2,4 :10 3,5 :空白對照ddH20。
[0022] 圖4顯示SS-PCR快速鑒定瘤脛實(shí)蠅的應(yīng)用與驗證M:100bpDNALaddenl-12 :瘤 腔實(shí)繩B.tuberculata，13 :空白對照ddH20。
【具體實(shí)施方式】
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