一種長鏈非編碼RNA lncRNA-CRNN及其應(yīng)用
【專利說明】_種長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN及其應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種長鏈非編碼RNA及其應(yīng)用，具體涉及一種長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN及其應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]宮頸癌是出現(xiàn)在子宮頸移行帶或陰道部的子宮頸管內(nèi)膜上皮細(xì)胞與鱗狀上皮細(xì)胞交會處的惡性腫瘤。宮頸癌在女性中的發(fā)病率僅次于乳腺癌位居第二，死亡率則居于婦科惡性腫瘤之首，是威脅女性健康和生命的最常見的惡性腫瘤之一。我國是宮頸癌的高發(fā)國家，其發(fā)病率以2%_3%的速度逐年上升，并且呈現(xiàn)年輕化的趨勢。因此，針對宮頸癌及癌前病變的早期診斷與干預(yù)顯得尤為重要。
[0005]宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸是一個復(fù)雜的多階段的過程。1974年，德國病毒學(xué)家Zur Hausen首先提出人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)[1] ([1] Durst M，Gissmann L，lkenberg，et al.A papillomavirus DNA from acervical carcinoma and its prevalence in cancer b1psy samples from differentgeographic reg1ns[J].Prec Natl Acad Sci USA, 1983,80 (12):3812 ?3815.)。隨著對HPV與宮頸癌的關(guān)系的深入研究，目前認(rèn)為HPV是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要因素。然而，僅高危型HPV感染尚不足以導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，多種異常調(diào)控的基因和遺傳學(xué)因素的改變亦是腫瘤發(fā)展過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。
[0006]近年來，非編碼RNA在腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用是研究者們關(guān)心的焦點問題。其中長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt (nucleotide)，并且不翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA分子[2]([2] Carninci P，Kasukawa T，Katayama T， et al.The transcript1nal landscapeof the mammalian genome [J].Science，2005，309 (5740): 1559-1563.)D 近年來研究表明，IncRNA與許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如膀胱癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等[3 4]([3] Zhu Y Y，Yu M，Li Z H? et al.IncRNA，a newly identified long noncoding RNA，enhances human bladder tumor growth， invas1n， and survival[J].Urology，2010，77(2):510.el-510.e5.[4] Gupta R A，Shan N? Wang K C? et al.Long non-coding RNAH0TAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J].Nature，2010，464(7291):1071-1076.)。但是關(guān)于IncRNA在宮頸癌發(fā)生過程中的作用尚鮮有報道。因此，本發(fā)明通過IncRNA芯片技術(shù)尋找在宮頸癌組織中異常表達(dá)的IncRNA，以期為宮頸癌的診斷、預(yù)后判斷發(fā)掘新的生物標(biāo)志物，以及為宮頸癌的治療提供突破點。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明的目的是提供一種在宮頸癌組織中表達(dá)顯著降低的長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN及其應(yīng)用。本發(fā)明的長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，是與人類宮頸癌發(fā)生密切相關(guān)的長鏈非編碼RNA。
[0009]技術(shù)方案:
一種長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0010]含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒P⑶H-lncRNA-CRNN。
[0011]含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組病毒IncCRNN。
[0012]含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組病毒載體。
[0013]所述長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN在制備診斷宮頸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0014]長鏈非編碼RNA IncRNA-CRNN在制備治療宮頸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明利用IncRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測宮頸癌組織中IncRNA的表達(dá)情況，通過差異分析篩選到IncRNA-CRNN的表達(dá)顯著降低；熒光定量PCR實驗進(jìn)一步證實IncRNA-CRNN在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織。提取宮頸癌組織及癌旁組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計IncRNA-CRNN PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首次克隆獲得IncRNA-CRNN基因。構(gòu)建表達(dá)IncRNA-CRNN的重組慢病毒，以獲得過表達(dá)IncRNA-CRNN的SiHa宮頸癌細(xì)胞系，研究IncRNA-CRNN對SiHa細(xì)胞增殖、迀移、侵襲以及惡性程度的影響，從而探討IncRNA-CRNN在宮頸癌發(fā)病過程中的作用，及其作為新的腫瘤標(biāo)記物在宮頸癌臨床診斷、治療和藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
[0016]
有益效果:
本發(fā)明提供的IncRNA-CRNN在宮頸癌組織中呈現(xiàn)低水平表達(dá)，在宮頸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。人為過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞中的IncRNA-CRNN，能夠明顯抑制SiHa細(xì)胞的增殖、迀移、侵襲能力和惡性程度，表明IncRNA-CRNN在宮頸癌發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，可以作為診療宮頸癌的新的分子標(biāo)記和藥物靶點。
[0017]
【附圖說明】
[0018]圖1為IncRNA芯片結(jié)果火山示意圖，顯示3對宮頸癌及癌旁組織中差異表達(dá)達(dá)2倍以上的IncRNA的分布；
圖2為Real-time PCR檢測IncRNA-CRNN在13對宮頸癌及癌旁組織中的表達(dá)示意圖；圖3為過表達(dá)IncRNA-CRNN的SiHa細(xì)胞系中IncRNA-CRNN的表達(dá)示意圖，(A)熒光顯微鏡觀察慢病毒P⑶Η或IncCRNN感染SiHa細(xì)胞48 h后的GFP表達(dá)(100X ) ；Phase:白光視野；GFP:熒光視野；(B)Real-time PCR檢測慢病毒pCDH或IncCRNN感染SiHa細(xì)胞72 h后IncRNA-CRNN的表達(dá)情況；
圖4為過表達(dá)IncRNA-CRNN的SiHa細(xì)胞系的CCK-8增殖實驗結(jié)果示意圖；
圖5為過表達(dá)IncRNA-CRNN的SiHa細(xì)胞系的軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果示意圖，(A)熒光顯微鏡觀察慢病毒P⑶Η或IncCRNN感染SiHa細(xì)胞14 d后的克隆形成情況(100 X );Phase:白光視野；GFP:熒光視野；(B)圖5A的結(jié)果統(tǒng)計； 圖6為過表達(dá)IncRNA-CRNN的SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞迀移實驗結(jié)果示意圖，(A)Transwell迀移實驗中于接種6 h和12 h后迀移至小室底部的細(xì)胞圖片；(B)圖6A的結(jié)果統(tǒng)計；
圖7為過表達(dá)IncRNA-CRNN的SiHa細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果示意圖，(A)Transwell侵襲實驗中于接種12 h和24 h后穿膜至小室底部的細(xì)胞圖片；(B)圖7A的結(jié)果統(tǒng)計。
[0019]
【具體實施方式】
[0020]以下結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，或按照制造廠商所建議的條件與實驗步驟。
[0021 ] 實施例1:1ncRNA-CRNN在宮頸癌組織中的表達(dá) 1.材料
1.1組織
本發(fā)明的臨床組織標(biāo)本均來自2013年11月至2015年6月于南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院婦產(chǎn)科治療的Ibl期宮頸癌患者，每對標(biāo)本包含手術(shù)切除的宮頸癌組織和配對的癌旁組織。所有標(biāo)本的使用均由患者或其委托人簽署知情同意書，得到了南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。
[0022]1.2 試劑
TRIzol? Reagent購自美國Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DDR037A)購自寶生物工程(大連)有限公司。焚光實時(Real-time)定量PCR (polymerase chain react1n)所用的 SYBR Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)試劑盒為日本 Takara 公司生產(chǎn)。Real-timePCR特異性引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。ArrayStar公司的IncRNA芯片產(chǎn)品(Human LncRNA Microarray V3.0Service)由上?？党缮锕こ逃邢薰敬?。
[0023]2.方法