一種cyp3a5*3的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種CYP3A5*3的檢測(cè)試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞色素P450 (cytochromeP450或CYP450)簡(jiǎn)稱(chēng)CYP450,是一種主要存在于肝臟、 腸道中的單加氧酶。CYP450是人體內(nèi)參與內(nèi)源性物質(zhì)和外源性化合物代謝過(guò)程的一組超家 族酶類(lèi)，尤其在藥物的體內(nèi)代謝過(guò)程中扮演重要角色。其中，CYP3A5參與他克莫司、咪達(dá)唑 侖、氨苯砜、可的松、尼菲地平等多種藥物的代謝。
[0003] CYP3A5 的一個(gè)SNP，rs776746 (CYP3A5*3,6986A>G)，會(huì)導(dǎo)致CYP3A5 基因的mRNA過(guò) 短地剪切，形成一個(gè)"不完整的"CYP3A5蛋白，從而導(dǎo)致CYP3A5酶蛋白活性的降低甚至消 失。攜帶CYP3A5突變型等位基因的患者在臨床藥物治療過(guò)程中的表現(xiàn)與野生型攜帶者大 相徑庭。例如，在臨床器官移植術(shù)后使用的主要免疫抑制劑類(lèi)藥物他克莫司（tacrolimus， FK506)，其代謝過(guò)程主要由CYP3A5進(jìn)行調(diào)控。如果CYP3A5基因出現(xiàn)突變，則會(huì)導(dǎo)致病人體 內(nèi)他克莫司的血藥濃度大幅度增高，并出現(xiàn)腎毒性、神經(jīng)毒性、高血壓和胃腸道紊亂等一系 列藥物毒副作用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，CYP3A5*3等位基因在中國(guó)人群中出現(xiàn)的頻率約為75%，因此，在 我國(guó)，檢測(cè)CYP3A5基因分型對(duì)于臨床治療，特別是器官移植術(shù)后病人的臨床用藥治療實(shí)現(xiàn) 個(gè)體化安全用藥具有重要的指導(dǎo)作用。
[0004] 目前，關(guān)于CYP3A5基因分型的檢測(cè)多采用熒光定量PCR、因測(cè)序以及基因芯片等 技術(shù)手段。使用這些方法進(jìn)行CYP3A5基因分型檢測(cè)均不同程度存在購(gòu)買(mǎi)儀器成本高，操作 程序復(fù)雜，檢測(cè)周期較長(zhǎng)等問(wèn)題，不利于提高檢測(cè)效率并實(shí)現(xiàn)臨床推廣普及。因此，尋找一 種高效且價(jià)格容易被患者接受的檢測(cè)手段和試劑盒，對(duì)于CYP3A5基因分型檢測(cè)有著重要 的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的問(wèn)題是現(xiàn)有的檢測(cè)CYP3A5基因型的方法成本較高，操作復(fù)雜，需 要的測(cè)試時(shí)間長(zhǎng)。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種CYP3A5*3的檢測(cè)引物，其包括以下引物：
[0007]5'-CAACTGCCCTTGCAGCATTT-3r (SEQ IDNo.1)
[0008] 5r -ACTGTTCTGATCACGTCGGG-3 r (SEQ IDNo.2)
[0009] 5r -AAAGAGCTCTTTTGTCTTTAAG-3r(SEQ IDNo. 3)
[0010] 5' -GGTCCAAACAGGGAAGAGAGAT-3，（SEQ IDNo. 4)。
[0011] 其中，引物P和Q是針對(duì)CYP3A5設(shè)計(jì)的特異引物，引物F和R是針對(duì)rs776746位 點(diǎn)的等位基因設(shè)計(jì)的特異性引物，F(xiàn)對(duì)應(yīng)G等位基因，R對(duì)應(yīng)T等位基因。為進(jìn)一步降低可 能的非特異性擴(kuò)增，本發(fā)明又人為地在F和R引物3'端倒數(shù)第三位引進(jìn)一個(gè)突變堿基。
[0012] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，包括上述的引物，還 包括PCR緩沖液，Taq酶和dNTP。
[0013] 優(yōu)選地，使用時(shí)，所述各引物的濃度均為200μΜ。
[0014] 優(yōu)選地，所述試劑盒中，dNTP為100μΜ。
[0015] 優(yōu)選地，所述試劑盒中，Taq酶為50U/mL。
[0016] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種CYP3A5*3的檢測(cè)方法，其使用上述的試劑盒， 包括以下步驟：
[0017] (l)PCR反應(yīng)
[0018] 以待檢測(cè)的核酸為模板，對(duì)CYP3A5*3位點(diǎn)進(jìn)行PCR處理，得到的產(chǎn)物記為N;
[0019] (2)電泳
[0020] 將步驟⑴中得到的N進(jìn)行凝膠電泳，將得到的電泳圖與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照。
[0021] 優(yōu)選地，所述步驟⑴中對(duì)CYP3A5*3位點(diǎn)進(jìn)行PCR處理的條件為：
[0022] (a)95°CT3min;
[0023] (b)95°C下 15s，55°C下 15s，72°C下 30s，循環(huán) 35 次。
[0024] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中，模板在試劑盒中的濃度為0.8~4ng/μL。
[0025] 優(yōu)選地，步驟（2)中電泳的條件為：取步驟（1)中得到產(chǎn)物Ν5yL，用2%的瓊脂 糖凝膠經(jīng)染色后在6v/cm電壓下電泳30min。
[0026] 突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)又稱(chēng)等位基 因特異性擴(kuò)增法（allelespecificamplification,ASA)，是Newton等首先建立用來(lái)檢測(cè) 已知突變的方法。其基本原理是，如果引物的3'端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則用一般耐熱 DNA聚合酶無(wú)法延伸。因此根據(jù)已知點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)3條引物（見(jiàn)引物設(shè)計(jì)），其3'端堿基分 別與突變和正常的模板堿基互補(bǔ)，從而將有某種點(diǎn)突變的模板與正常模板區(qū)分開(kāi)來(lái)。此法 已用于多種疾病的點(diǎn)突變的檢測(cè)。
[0027] 本發(fā)明在A(yíng)RMS-PCR的基礎(chǔ)上采用雙向擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(Bi-Amplification RefractoryMutationSystemPCR，BI-ARMS-PCR)技術(shù)，設(shè)計(jì)出檢驗(yàn)CYP3A5*3 的試劑盒。 針對(duì)rs776746的兩個(gè)等位基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)讀取電泳的條帶個(gè)數(shù)及大小來(lái)判定 待測(cè)樣本中的rs776746位點(diǎn)堿基，從而判斷被測(cè)試者是否攜帶CYP3A5*3,指導(dǎo)被測(cè)試者用 藥。
[0028] 本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0029] (1)本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)成本低：無(wú)需DNA測(cè)序儀，僅需普通熱循環(huán)儀和普通 的瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備即可開(kāi)展檢測(cè)，有利于推廣至地方醫(yī)院檢測(cè)或者普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行科 研工作。
[0030] (2)本試劑盒操作簡(jiǎn)便、測(cè)試時(shí)間短無(wú)需PCR產(chǎn)物純化、測(cè)序引物設(shè)計(jì)、測(cè)序反應(yīng) PCR的純化、測(cè)序反應(yīng)化學(xué)類(lèi)型選擇等步驟，只需要PCR和電泳的這兩個(gè)操作步驟，簡(jiǎn)便易 行?，F(xiàn)有的基因測(cè)序法最快也要八個(gè)小時(shí)，而本發(fā)明從DNA提取到基因分型完成，僅需2個(gè) 小時(shí)，較好地縮短了檢測(cè)時(shí)間。
【附圖說(shuō)明】
[0031 ] 圖1是檢測(cè)樣本1-5經(jīng)PCR得到的產(chǎn)物（NfNs)的電泳圖。
[0032] 圖2-圖6分別為檢測(cè)樣本l-5rs776746位點(diǎn)的DNA測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描 述。
[0034] -種CYP3A5*3的檢測(cè)引物，其包括以下引物：
[0035] 5' -CAACTGCCCTTGCAGCATTT-3' （SEQ IDNo.1，以下簡(jiǎn)稱(chēng)P)
[0036] 5' -ACTGTTCTGATCACGTCGGG-3' (SEQ IDNo. 2,以下簡(jiǎn)稱(chēng)Q)
[0037] 5' -AAAGAGCTCTTTTGTCTTTAAG-3，（SEQ IDNo.3,以下簡(jiǎn)稱(chēng)F)
[0038] 5' -GGTCCAAACAGGGAAGAGAGAT-3'（SEQ IDNo. 4,以下簡(jiǎn)稱(chēng)R)。
[0039] 一種CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，包括上述的引物，還包括緩沖液，Taq酶和dNTP。 試劑盒中各組分的濃度可按現(xiàn)有的進(jìn)行PCR所需的濃度進(jìn)行。作為一種優(yōu)選方案，本實(shí)施 例中，各引物的濃度均為200μM，dNTP為100μM，Taq酶為50U/mL。緩沖液可使用常用的 與Taq酶配合使用的緩沖液。為了進(jìn)一步增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)效果，試劑盒中也可加入常見(jiàn)的增強(qiáng)劑 (enhancer)〇
[0040] 使用本試劑盒，使用本發(fā)明提供的CYP3A5*3檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)，包括以下步驟：
[0041] 1核酸提?。?br>[0042] 抽取5個(gè)人1ml靜脈血后，以EDTA抗凝管保存，每管取200ul血液，用全式金或者 其它公司的DNA提取試劑盒，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取全基因組DNA作為檢測(cè)的模板，記為T(mén)， 依次編號(hào)為?\、T2、T3以此類(lèi)推至T5。
[0043] 2.PCR反應(yīng)
[0044] 以Τη為模板，加入試劑盒中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到產(chǎn)物Nn。PCR反應(yīng)的條件可按照 現(xiàn)有的常用條件進(jìn)行。作為一種優(yōu)選方案，本實(shí)施例中，采用以下條件：
[0045] (1)預(yù)變性：溫度95°C時(shí)間3min。
[0046]⑵擴(kuò)增循環(huán)：（2-1)變性：溫度95°C，時(shí)間15s;
[0047] (2-2)退火：溫度 55°C，時(shí)間15s;
[0048](2-3)延伸：溫度 72°C，時(shí)間30s;
[0049] 循環(huán)35次。
[0050] 進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，試劑盒中各組分的濃度和總反應(yīng)體系的量可按常規(guī)PCR反應(yīng)所 需進(jìn)行。本實(shí)施例中，反應(yīng)體系共計(jì)25μL，成分和含量如表1所示：
[0051]表1
[0052]
[0053] 3.凝膠電泳
[0054] 將步驟2得到的Νη，取5μ1，用2 %的瓊脂糖凝膠（G00DVIEW染色）在6v/cm電 壓下電泳30min，觀(guān)察結(jié)果。圖1為檢測(cè)樣本中1-5PCR產(chǎn)物的的電泳圖。圖中最左為DNA ladder Marker，從上致下依次為2400bp、2200bp、2000bp、1800bp、1600bp、1400bp、1200bp、 1000bp、800bp、600bp、400bp和200bp。
[0055] 已知的標(biāo)準(zhǔn)電泳結(jié)果分析如表2所示：
[0056] 表 2
[0057]
[0058] 將圖1得到的電泳圖與表2中的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，檢測(cè)的5個(gè)樣本CYP3A5基因型的結(jié)果 如表3所示：
[0059] 表 3
[0060]
[0061] 為了驗(yàn)證本試劑盒和檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，將檢測(cè)樣本1-5的rs776746位點(diǎn)進(jìn)行基 因測(cè)序，其結(jié)果如圖2-圖6所示。
[0062] 將表3中得到的結(jié)果與圖2-圖6的DNA測(cè)序結(jié)果對(duì)比可知，本試劑盒測(cè)試的結(jié)果 與DNA測(cè)序結(jié)果吻合率100 %。
[0063] 以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例， 不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的實(shí)施范圍。凡依本發(fā)明范圍所作的均等變化與改進(jìn)等，均應(yīng) 仍歸屬于本專(zhuān)利涵蓋范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種CYP3A5*3的檢測(cè)引物，其特征在于：包括以下引物： 5'-CAACTGCCCTTGCAGCATTT-3r(SEQIDNo. 1) 5r -ACTGTTCTGATCACGTCGGG-3r(SEQIDNo. 2) 5r -AAAGAGCTCTTTTGTCTTTAAG-3r(SEQIDNo. 3) 5r -GGTCCAAACAGGGAAGAGAGAT-3r(SEQIDNo. 4)〇2. -種CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于：還包括緩 沖液，Taq酶和dNTP。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：使用時(shí)，所述各引物 的濃度均為200μM。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述dNTP為100μΜ。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述Taq酶為50U/ mL〇6. -種CYP3A5*3的檢測(cè)方法，其特征在于：使用權(quán)利要求2-5所述的試劑盒，包括以 下步驟： (1)PCR反應(yīng) 以待檢測(cè)的核酸為模板，對(duì)CYP3A5*3位點(diǎn)進(jìn)行PCR處理，得到的產(chǎn)物記為N; (2) 電泳 將步驟（1)中得到的N進(jìn)行凝膠電泳，將得到的電泳圖與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的CYP3A5*3的檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟（1)中對(duì) CYP3A5*3位點(diǎn)進(jìn)行PCR處理的條件為： (a) 95°C下 3min; (b) 95°C下 15s，55°C下 15s，72°C下 30s，循環(huán) 35 次。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的CYP3A5*3的檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟（1)中， 模板在試劑盒中的濃度為〇. 8~4ng/μL。9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的CYP3A5*3的檢測(cè)方法，其特征在于：步驟（2)中電泳的 條件為：取步驟（1)中得到產(chǎn)物5μL，用2 %的瓊脂糖凝膠經(jīng)染色后在6v/cm電壓下電泳 30min〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種CYP3A5*3的檢測(cè)試劑盒，屬于分子生物學(xué)及核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在A(yíng)RMS-PCR的基礎(chǔ)上采用雙向擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(Bi-Amplification？Refractory？Mutation？System？PCR，BI-ARMS-PCR)技術(shù)，設(shè)計(jì)出檢驗(yàn)CYP3A5*3的試劑盒。針對(duì)rs776746的兩個(gè)等位基因設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)讀取電泳的條帶個(gè)數(shù)及大小來(lái)判定待測(cè)樣本中的rs776746位點(diǎn)堿基，從而判斷被測(cè)試者是否攜帶CYP3A5*3，指導(dǎo)被測(cè)試者用藥。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN105274221
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510661496
【發(fā)明人】汪大為
【申請(qǐng)人】北京晉祺生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日