測定人NEFL基因rs2979704位點多態(tài)性的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及測定單核苷酸多態(tài)性的方法。
【背景技術】
[0002] SNP(單核苷酸多態(tài)性）是指單個核苷酸的改變引起的DNA序列變異，包括單堿基 的置換、插入和缺失等形式。基因多態(tài)性是個體與生倶來的遺傳特征，不隨環(huán)境發(fā)生變化， 也不是某種疾病特異或者非特異的臨床表現(xiàn)，因此其應用并不存在診斷和治療作用。
[0003] 基因多態(tài)性檢測在遺傳學領域和醫(yī)學領域中應用廣泛，舉例如下：1.研究物種起 源和進化等遺傳學現(xiàn)象。根據(jù)基因變異情況，獲得生物大分子的信息，推斷生物進化歷史， 闡明物種進化關系。應用于考古學中以確定古人類遺傳變異特征以及不同種群的親緣關 系。2.研究多態(tài)與種群未緣關系等遺傳學研究。多態(tài)亦與各種人體特征密切相關，包括身 高、體重、膚色、相貌特征等等。3.在預防醫(yī)學領域可以用于疾病預防措施。通過研究人體 對毒物的耐受性，發(fā)現(xiàn)易于對某種毒物發(fā)生毒性作用的個體，及時避免該個體與毒物接觸， 保護該易感人群。例如，對準備從事接觸苯等有機溶劑的人群進行多態(tài)檢測，篩查出容易出 現(xiàn)血液毒性、神經(jīng)毒性等反應的個體，令其遠離苯等有機溶劑，保護此類易感人群免受毒物 侵害。4.藥理學中可以用于藥物選擇以及劑量確定。通過多態(tài)檢測可以判斷患病個體對某 種藥物毒副作用敏感，從而避免使用此種藥物以免除其毒性作用。通過判斷個體對藥物效 果的反應程度確定藥物劑量，減少藥物用量及其副作用。
[0004] 神經(jīng)纖維絲（Neurofilaments,NFS)是真核生物細胞中主要的細胞骨架元素，主 要存在于神經(jīng)元中。其按分子量不同可分為三種亞單元，即分子量為68kd的低分子量 神經(jīng)纖維絲（Neurofilment,lightpolypeptide,NEFL)，150kd大小的中等大小分子量 神經(jīng)纖維絲（Neurofilament,mediumpolypeptide,NEFM),和 200kd的高分子量神經(jīng)絲 (Neurofilament,heavypolypeptid,NEFH)。每種亞單元都是單個基因產(chǎn)物，在細胞骨架中 起到重要的作用。
[0005] 低分子量神經(jīng)纖維絲基因又稱為神經(jīng)纖維絲輕鏈基因，是近年來研究較多的一種 細胞骨架基因，定位于染色體8p21，有4個外顯子。有研究表明NEFL基因多態(tài)性可能與其 編碼的蛋白功能有關。NEFL基因rs2979704位點位于UTR-3區(qū)域，有研究表明該多態(tài)可能 影響NEFL的功能。
[0006] NEFL基因rs2979704位點多態(tài)，在人群中存在兩種等位基因C和T，形成三種NEFL 基因的基因型：CC型（人體基因組rs2979704多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為C)，CT型 (人體基因組rs2979704多態(tài)位點的兩個等位基因堿基分別為C和T)和TT型（人體基因 組rs2979704多態(tài)位點的兩個等位基因堿基均為T)。
[0007] 聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態(tài)（PCR-RFLP)技術是一種快速、簡便、準 確、低成本測定SNP(單核苷酸多態(tài)性）基因型的經(jīng)典方法。該方法通過引物來對模板進 行擴增反應，形成足夠數(shù)量和穩(wěn)定的擴增產(chǎn)物，通過對擴增產(chǎn)物的酶切和檢測酶切產(chǎn)物的 片段長度，最終測定出SNP。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有限制性內切酶可以識別含NEFL基因 rs2979704多態(tài)位點的堿基序列，不能采取PCR-RFLP技術進行檢測。因此需要開發(fā)新的 檢測技術。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種非疾病診斷或治療目的用的測定人NEFL基因 rs2979704位點多態(tài)性的可靠手段。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種測定人NEFL基因rs2979704位點多態(tài)性的方 法，包括：
[0010] 提供待測人基因組DNA;
[0011] 提供擴增人NEFL基因rs2979704位點附近序列的上游引物和下游引物，其中上游 引物具有錯配喊基G;
[0012] 以所述待測人基因組DNA為模板，利用上游引物和下游引物進行PCR擴增反應以 獲得含AGATYT片段或GATY片段的擴增產(chǎn)物，其中Y為人NEFL基因rs2979704位點上的待 定堿基C或T;
[0013] 提供限制性內切酶；
[0014] 利用限制性內切酶對所得擴增產(chǎn)物進行酶切（反應）以獲得相應的酶切產(chǎn)物；以 及
[0015] 根據(jù)所得酶切產(chǎn)物來確定人NEFL基因rs2979704位點上的待定堿基Y是C還是 T，其中，限制性內切酶為僅能夠切開AGATCT片段與AGATTT片段之一的限制性內切酶，或為 僅能夠切開GATC或GATT片段之一的限制性內切酶。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物的錯配堿基G與Y之間相隔兩 個堿基AT。令人驚訝的是，如此設置錯配堿基將使酶切反應進行得極其順利，不會出現(xiàn)酶切 不充分等現(xiàn)象。并且，如此設置上游引物錯配堿基使PCR反應進行順利，提高了PCR的靈敏 度和特異度，這可能與錯配堿基后使得擴增序列的二級結構改變有關。
[0017] 在本發(fā)明的一個可選實施例中，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基與Y相鄰。
[0018] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，在所得擴增產(chǎn)物上，上游引物末端堿基不與Y相 鄰。例如，上游引物末端可以是……GAT、……GA等結構。難以想象，具有這種設計的上游 引物竟然會進一步大大促進酶切反應，這可能與擴增結合力有某種關聯(lián)。
[0019] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，限制性內切酶可以采用僅能切開AGATCT片段的 BglII或其同裂酶。這類BglII酶價格低廉，能大大降低測定成本。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所得酶切產(chǎn)物包括三種片段類型：具有總片段長度的未切 斷擴增產(chǎn)物、切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物以及切斷后具有較短片段的擴增產(chǎn)物（較短 片段通常不能有效觀測到）。通過觀測（判斷）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型來確定人NEFL 基因rs2979704位點上的待定堿基是C還是T。例如，在采用Bglll酶的情況下，根據(jù)總片 段和切斷后較長片段這兩個片段的觀察結果來進行判斷：如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具 有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物，則待定堿基為T;如果觀察到酶切產(chǎn)物只有一種具有較 長片段（小于總片段長度）的切斷產(chǎn)物，則待定堿基為C;如果觀察到上述二者，則待定堿 基既包括C又包括T。
[0021] 在本發(fā)明的一個實施例中，判斷（或觀測）酶切產(chǎn)物所包含的片段類型是通過凝 膠電泳聯(lián)合紫外燈拍照后與參照圖對比來進行的。這種情況下，優(yōu)選參照圖是擴增產(chǎn)物在 凝膠電泳標準設定時間后經(jīng)紫外燈拍照后而得且僅具有第一參照圖像位置和第二參照圖 像位置，其中第一參照圖像位置針對的是未切斷的總片段長度的擴增產(chǎn)物，而第二參照圖 像位置則針對的是切斷后具有較長片段的擴增產(chǎn)物。例如，本發(fā)明采用的參照圖是由合成 的156bp和121bp兩個堿基片段同時經(jīng)凝膠電泳相同時間后紫外燈拍照而成。與常規(guī)DNA ladder的復合參照圖相比，由于采用了僅具有兩個特定參照圖像位置的參照圖，本發(fā)明的 這種方法能夠直觀快速地觀測或判斷酶切產(chǎn)物所包含的片段類型，同時最大限度地避免了 誤判。酶切反應后優(yōu)選將酶切產(chǎn)物濃縮1~2倍濃度后進行電泳，增加圖像亮度，提高判斷 準確性。
[0022] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過設計上游引物和下游引物的長度而使得擴增產(chǎn)物 的總片段長度在100至300bp之間，并且上游引物的片段長度至少為35bp，優(yōu)選長度40~ 60bp(在該優(yōu)選區(qū)間擴增反應尤其順利充分），使得酶切切掉部分片段長度占總片段長度 的百分比超過20%。本發(fā)明的這種設計可以使得具有總片段長度的未切斷擴增產(chǎn)物與切斷 后具有較長片段的擴增產(chǎn)物的電泳紫外照片的位置區(qū)別顯著。但是，如果總片段過長，則電 泳位移將不明顯；過短則圖像會變得模糊一片，無法準確區(qū)分。上游引物的片段長度范圍保 證了PCR擴增反應能夠順利進行，避免了錯配堿基時會出現(xiàn)的擴增不足現(xiàn)象。
[0023] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中退火溫度的范圍在55~70°C 之間，優(yōu)選溫度60~69°C(該溫度可提高擴增反應的特異性），使得設計的PCR產(chǎn)物純度 較高。本發(fā)明的這種設計可以使得PCR擴增產(chǎn)物條帶清楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別。但 是，如果溫度過低，則特異條帶少且雜帶過多，電泳后難以區(qū)分判斷；如果溫度過高，則影響 PCR擴增效率使得特定擴增產(chǎn)物過少，影響觀察效果。
[0024] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，通過控制PCR擴增程序中延伸時間的范圍在10~60s 之間，優(yōu)選時間15~30s(該時間可提高擴增反應的效率和擴增產(chǎn)物的特異性），使得設計 的PCR反應時間較短，擴增產(chǎn)物純度較高。本發(fā)明的這種設計可以使PCR擴增產(chǎn)物條帶清 楚，無雜帶出現(xiàn)，易于電泳識別，而且PCR時間較短。但是，如果時間過短，則特異條帶不能 完全擴增而使得擴增產(chǎn)物較少，電泳后難以區(qū)分判斷；如果時間過長，則增加非特異條帶的 出現(xiàn)幾率，出現(xiàn)雜帶影響觀察效果。
[0025] 在本發(fā)明中，PCR反應成分可以包含DNA模板、上下游引物、TaqDNA polymerase(DNA聚合酶或亦可稱作"Taq酶"）、緩沖液、Mg2+等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例 中，PCR擴增反應中可以使用TaqDNApolymerase及其TaqAntibody。TaqAntibody是 TaqDNApolymerase的單克隆抗體，其與TaqDNApolymerase結合后抑制DNA聚合酶活 性，兩者的親和力非常高，即使在65°C下仍然可以封閉TaqDNApolymerase的活性，因此 可以非常有效地抑制引物的非特異性退火及引物二聚體引起的非特異性擴增，具有極高的 擴增靈敏度和特異性。TaqAntibody只需要在95°C加熱30s即可完全失活，釋放TaqDNA polymerase活性，保證了后續(xù)PCR擴增反應能夠順利進行。