用于預(yù)防和/或治療眼科疾病的方法的修飾的TGF-β寡核苷酸的制作方法
【專利說明】用于預(yù)防和/或治療眼科疾病的方法的修飾的TGF-β寡核 苷酸
[0001] 本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療眼科疾病的方法的TGF-β寡核苷酸，其包含橋接 核苷酸，聚環(huán)氧烷、2' -氟、2' -0-甲氧基和/或2' -0-甲基修飾的核苷酸。 技術(shù)背景
[0002] 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)是一種例如控制增殖或細胞分化的多功能生長因子， 其是涉及發(fā)育或組織修復(fù)的生理或病理過程中調(diào)控眼組織中細胞行為的最重要配體之一， 雖然還涉及多種其他生長因子。該配體活性增加可誘導不利的炎性應(yīng)答和組織纖維化。在 哺乳動物中，已知三種TGF-β的同種型，S卩β1、β2和β3。在大多數(shù)情況中，TGF-β增強 胞外基質(zhì)生產(chǎn)并抑制細胞增殖。此外，TGF-β能夠誘導多種生長因子，即結(jié)締組織生長因 子（CTGF)、血小板衍生生長因子（PDGF)、成纖維細胞生長因子（FGF)和血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)以及TGF-βΙ本身。所有這些因子都在損傷后的正常組織恢復(fù)中具有重要作用。
[0003] 潤濕內(nèi)部眼結(jié)構(gòu)（角膜內(nèi)皮、虹膜、晶狀體、小梁網(wǎng)和視網(wǎng)膜）的水狀液含有多種 細胞因子和生長因子。TGF-β(特別是TGF-I3 2)是主要的細胞因子。生理上，TGF-β主 要以潛伏、無活性的形式產(chǎn)生于睫狀體上皮和晶狀體上皮，該形式由成熟TGF-β、潛伏相 關(guān)肽（LAP)(小潛伏形式）和潛伏-TGF-β-結(jié)合蛋白（LTBP)組成。已在人和動物中報道 了晶狀體中各TGF-β同種型的異質(zhì)性表達模式。在多種眼科疾病的臨床期間，水狀液中 TGF-β2的濃度發(fā)生變化。例如，在具有增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變（PVR)(-種后視網(wǎng)膜脫 落和視網(wǎng)膜纖維化的疾?。┑难壑?，玻璃體中TGF-β2的濃度隨著視網(wǎng)膜纖維化的進展而 升高。與正常對象相比，糖尿病性視網(wǎng)膜病變和開角型青光眼的患者中總TGF-β2和活性 TGF-β2的濃度也較高。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜微血管的慢性阻塞誘導VFGF上 調(diào)和巨噬細胞的趨化作用（TGF-β的主要來源KVEGF和TGF-β聯(lián)合誘導視網(wǎng)膜新血管形 成和圍繞這些新血管的纖維化，這會潛在導致視網(wǎng)膜脫落或出血。升高的TGF-β2水平誘 導小梁網(wǎng)細胞中基質(zhì)表達和沉積，導致青光眼中排水路徑的阻塞和眼內(nèi)壓的升高。在各實 施例中，TGF-β都在疾病發(fā)生中起作用。在具有假性表皮脫落綜合征（pseudoexforiation syndrome)(-種類型的青光眼，其在晶狀體、虹膜或小梁網(wǎng)上具有表皮脫落材料沉積）的 眼中，TGF-β1的水平升高，但TGF-β1在該疾病發(fā)病機理中的確切作用仍然未知（參見 ShizuyaSaika,LaborartoryInvestigation(2006)，86, 106-115)〇
[0004]TGF-β是胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積的最有力調(diào)控因子之一。其通過兩種主要機制刺 激胞外基質(zhì)的產(chǎn)生并影響其粘附性質(zhì)。首先，TGF-β刺激成纖維細胞和其他細胞產(chǎn)生胞外 基質(zhì)蛋白和細胞粘附蛋白，包括膠原、纖連蛋白和整聯(lián)蛋白。其次，TGF-β減少降解胞外基 質(zhì)的酶（包括膠原酶、肝素酶和間質(zhì)溶解素）的產(chǎn)生，并增加抑制降解胞外基質(zhì)的酶的蛋白 質(zhì)（1型纖溶酶原激活物抑制劑和金屬蛋白酶的組織抑制劑）的產(chǎn)生。這些變化的凈作用 是增加胞外基質(zhì)蛋白的產(chǎn)生并以細胞特異性方式提高或降低細胞的粘附性質(zhì)（參見Blobe GC等，2000 年 5 月，〃Roleoftransforminggrowthfactorbetainhumandisease(人 疾病中轉(zhuǎn)化生長因子β的作用）〃，N.Engl.J.Med. 342 (18)，1350-1358)。
[0005] 已提出靶向TGF-β作為例如青光眼中的潛在治療性措施?？紤]到 TGF-β在青光眼發(fā)病機理中的多個方面，治療應(yīng)涉及調(diào)節(jié)其產(chǎn)生、激活、與受體相 互作用、下游胞內(nèi)調(diào)節(jié)機制和/或最終結(jié)構(gòu)和ECM變化（參見PrendesMA等，BrJ Ophthalmol(2013)，97, 680-686)。
[0006] 基于慢性增加的眼內(nèi)壓，青光眼（GCM)是一種以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的進行性 缺失為特征的進行性視神經(jīng)病變，其在臨床上體現(xiàn)為視神經(jīng)盤神經(jīng)視網(wǎng)膜邊緣組織缺 失、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層中的缺陷和功能性視域測試的缺陷（參見Danesh-Meyer等， Ophthalmol. 2006, 113:603-611)。青光眼是美國成人中失明的第二大主要原因。雖然有多 種治療選擇（包括難治患者中的手術(shù)過程），但失明仍是一種主要威脅。原發(fā)性開角型青光 眼（P0AG)是美國國內(nèi)青光眼的最常見形式。在世界范圍內(nèi)，2000年時患有P0AG的人數(shù)預(yù) 測為6680萬人，其中670萬人雙側(cè)失明（參見Quingley，BrJOphthalmol. 1996年5月； 80(5) :389-393) 〇
[0007] 白內(nèi)障手術(shù)是最常見的眼科手術(shù)過程。僅僅在美國，每年進行最多300萬例白 內(nèi)障手術(shù)。目前美國政府每年花費超過30億美元用于治療白內(nèi)障（僅醫(yī)保患者）。通 過手術(shù)移除眼的晶狀體，并植入眼內(nèi)晶狀體。晶狀體囊維持在原位，且該囊的前半部 分經(jīng)常由于機械破壞和晶狀體替換相關(guān)的其他潛在因素而發(fā)生后囊膜混濁（PC0)。該 病癥出現(xiàn)在20至40 %的PC0患者中，在最初的兩年內(nèi)進行YAG-激光后囊膜切開術(shù) (比率取決于國家、使用的晶狀體類型和手術(shù)經(jīng)驗）以除去混濁（參見JohanssonB 等，BrJOphthalmol(2010) ,94, 450-455;MathewRG等，OphthalmicSurgLasers Imaging(2010)，41，651-655)。使用YAG-激光與各種風險相關(guān)，包括視網(wǎng)膜脫落（1-3% )、 黃斑水腫（最高5%)和繼發(fā)性青光眼（參見BillotteC和BerdeauxG，JCataract RefractSurg(2004), 30(10), 2064-2071)〇
[0008]TGF-β與GCM和PC0的病理生理密切相關(guān)；迄今為止，已通過ALK5抑制劑（例 如參見W0 2009/146408)或針對TGF-β的抗體（即其同種型之一，其公開于例如TO 2012/167143)來抑制TGF-β蛋白的作用。迄今為止，這些化合物無一能夠成功地在眼中抑 制TGF-β并因此成功預(yù)防和/或治療諸如GCM或PC0的眼科疾病。
[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種寡核苷酸，優(yōu)選反義寡核苷酸，其特異性抑制TGF-β1、 TGF-β2 和 / 或TGF-β3mRNA，TGF-β1 和TGF-β2mRNA或TGF-β1 和TGF-β3mRNA或 TGF-β2和TGF-β3mRNA的表達，并因此能夠高度有效地用于預(yù)防和/或治療眼科疾病而不 導致任何（嚴重的）副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明涉及使用一種TGF-β寡核苷酸（優(yōu)選TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3 反義寡核苷酸）的用途，其用于治療眼科疾病（干眼病、青光眼或后囊膜混濁）的方法中。
[0011] 該TGF-β寡核苷酸由SEQIDNO. 1的TGF-β1核酸序列（參見圖1)或SEQID Ν0· 2的TGF-β2核酸序列（參見圖2)或SEQIDΝ0· 3的TGF-β3核酸序列（參見圖3) 的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾 的。本發(fā)明的一些寡核苷酸對應(yīng)于TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，或TGF-β1和TGF-β2或 TGF-β1和TGF-β3或TGF-β2和TGF-β3,且與這些序列中的一種或多種雜交。
[0012] 具體而言，用于本發(fā)明的寡核苷酸包含SEQIDNO. 2的第1380-1510號核酸區(qū)域 的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng) 修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β2表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核 苷酸包含或由以下序列組成：SEQIDN0. 5 (如ASPH36:GACCAGATGCAGGA)、SEQIDN0. 6 (如 ASPH80:GCGACCGTGACCAGAT)、SEQIDNO. 7(如ASPH98:GCGCGACCGTGACC)，SEQIDNO. 8(如 ASPH111:AGCGCGACCGTGA)，或SEQIDΝ0·9(如ASPH121 或ASPH153:GACCGTGACCAGAT)、 SEQIDN0·10(如ASPH15:CTGCCCGCGGAT)、SEQIDN0·11(如ASPH17:TCTGCCCGCGGAT)、 SEQIDΝ0·12(如ASPH26 或ASPH27:GGATCTGCCCGCGGA)、SEQIDΝ0·13(如 ASPH37:CTTGCTCAGGATCTGCC)、SEQIDNO. 14(如ASPH52 或 53:GCTCAGGATCTGCCCGCGGA)、 SEQIDN0·15(如ASPH112:GGATCGCCTCGAT)、SEQIDN0·16(如ASPH119:CCGCGGATCGCC)， 或SEQIDNO. 34(如ASPH30:CGATCCTCTTGCGCAT)。
[0013] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的第2740-2810號核酸區(qū)域的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或由其組成，該 寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β2 表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由以下序列組成：SEQIDN0. 60(如 ASPH65:TCTGAACTAGTACCGCC)、SEQIDΝ0·76(如ASPH82:AACTAGTACCGCCTTT)，或SEQID NO. 106(如ASPH115:CTAGTACCGCCTT)。
[0014] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDN0.2的 TGF-β2核酸序列的第1660-1680號核酸區(qū)域的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低 和抑制TGF-β1和/或TGF-β2表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或 由以下序列組成：SEQIDN0. 17(如ASHP01 或ASPH02:ACCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQID NO. 18(如ASPH03 或ASPH04:CCTCCTTGGCGTAGTA)、SEQIDNO. 19(如ASPH05、ASPH06 或 ASPH07:CTCCTTGGCGTAGTA)，或SEQIDΝ0· 20(如ASPH08:TCCTTGGCGTAGTA)。
[0015] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的第2390-2410號核酸區(qū)域的10-20個（優(yōu)選12-18個，最優(yōu)選13個）核苷酸或 由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑 制TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由 以下序列組成：SEQIDΝ0. 21 (如ASPH9 或ASPH10:CAGAAGTTGGCAT)。
[0016] 在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，其包含SEQIDNO. 2的TGF-β2 核酸序列的10-20個（優(yōu)選12-18個）核苷酸或由其組成，該寡核苷酸中的一個或多個核 苷酸是經(jīng)修飾的。這些寡核苷酸分別在降低和抑制TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3 (且 最優(yōu)選TGF-β2)表達和活性方面高度有效。優(yōu)選的寡核苷酸包含或由以下序列之一組成： SEQIDΝ0. 22-59、61-75、77-105、107-140 (例如ASHP11-ASPH14、ASPH16、ASPH18-ASPH25、 ASPH28-ASPH35、ASPH38-ASPH51、ASPH60-ASPH64、ASPH66-ASPH79、ASPH81、ASPH83-ASPH97、 ASPH99-ASPH110、ASPH113、ASPH114、ASPH116-ASPH118、ASPH120、ASPH122-ASPH152、 ASPH154-ASPH183,或T-LNA(SEQIDN0:144))。
[0017] 本發(fā)明中優(yōu)選的寡核苷酸分別是ASPH01、ASPH03、ASPH05、ASPH17、ASPH22、 ASPH26、ASPH27、ASPH35、ASPH36、ASPH37、ASPH45、ASPH47、ASPH48、ASPH65、ASPH69、ASPH71、 ASPH80、ASPH82、ASPH98、ASPH105、ASPH115、ASPH190、ASPH191、ASPH192和ASPH193。
[0018] 本發(fā)明中其他優(yōu)選的寡核苷酸是表1所示的ASPH1000至ASPH1132,其優(yōu)選抑制 TGFf3 ImRNA的表達和/或活性。該組中優(yōu)選的寡核苷酸分別是例如ASPH1047、ASPH1051、 ASPH1059、ASPH1106、ASPH1139、ASPH1150、ASPH1162、ASPH1163、ASPH1175、ASPH1178和 ASPH1181。
[0019] 在替代性實施方式中，寡核苷酸優(yōu)選抑制TGFi3 3mRNA的表達和/或活性。這 類寡核苷酸分別是例如ASPH2000、ASPH2001、ASPH2002、ASPH2003、ASPH2004、ASPH2005、 ASPH2006、ASPH2007、ASPH2008、ASPH2009、ASPH2010、ASPH2011、ASPH2012、ASPH2013、 ASPH2014、ASPH2015、ASPH2016、ASPH2017、ASPH2018、ASPH2019、ASPH2020、ASPH2021、 ASPH2022、ASPH2023、ASPH2024、ASPH2025、ASPH2026、ASPH2027、ASPH2028、ASPH2029、 ASPH2030、ASPH2031、ASPH2032、ASPH2033、ASPH2034、ASPH2035、ASPH2036、ASPH2037、 ASPH2038、ASPH2039、ASPH2040、ASPH2041、ASPH2042、ASPH2043、ASPH2044、ASPH2045、 ASPH2046、ASPH2047、ASPH2048、ASPH2049、ASPH2050、ASPH2051、ASPH2052、ASPH2053、 ASPH2054、ASPH2055、ASPH2056、ASPH2057、ASPH2058、ASPH2059、ASPH2060、ASPH2061、 ASPH2062、ASPH2063、ASPH2064、ASPH2065和ASPH2066。
[0020] 本發(fā)明的寡核苷酸顯示對TGF- β 1、TGF- β 2或TGF- β 3,或TGF- β 1和TGF- β 2 的意料之外的強且特異性抑制。或者，本發(fā)明的寡核苷酸顯示對TGF-β 1和TGF-β 3或 TGF- β 1和TGF- β 2或TGF- β 2和TGF- β 3,并在另一情況下顯示對TGF- β 1、TGF- β 2和 TGF-β 3的強且特異性抑制。
[0021] 本發(fā)明的核苷酸中的一個或多個核苷酸的修飾選自LNA、ΕΝΑ、聚環(huán)氧烷（如三甘 醇（TEG))、2'_氟、2'-0_甲氧基和2'-0_甲基。這些修飾優(yōu)選位于寡核苷酸的5'和/或 3'端。包含這類修飾的核苷酸的寡核苷酸是修飾的寡核苷酸。
[0022] 修飾的核苷酸是排列為例如一列（彼此緊鄰）或不同的模式（此時一個或多個未 修飾的核苷酸在一個修飾的核苷酸后）。例如，寡核苷酸以一個或多個修飾的核苷酸起始， 隨后是一個或多個（如一個、兩個、三個或四個）未修飾的或未鎖定的（unlocked)核苷酸， 隨后再是一個或多個修飾的核苷酸。在一個實施方式中，該核苷酸的兩端都包含相同模式 的修飾的和未修飾的或未鎖定的核苷酸。在另一個實施方式中，3'和5'端的修飾模式不 同，包括一端不包含修飾的核苷酸。優(yōu)選地，修飾的寡核苷酸包含一系列8或9個未鎖定的 核苷酸。
[0023] 或者，該寡核苷酸中任何其他位置的核苷酸，或者該寡核苷酸的5'和/或3' 端處和該寡核苷酸中的任何其他位置的至少一個核苷酸是經(jīng)修飾的。例如，ASPH1071、 ASPH1100、ASPH1109、ASPH1110、ASPH1111、ASPH1115、ASPH1126、ASPH1127和ASPH1128屬 于一組TGF-β寡核苷酸，例如TGF-β 1寡核苷酸，其包含處于不同模式（例如由未鎖定的 核苷酸隔開彼此）中的修飾的核苷酸（如LNA、ENA等）。這些寡核苷酸包含一種類型的修 飾，或一種或多種不同的修飾。任選地，寡核苷酸的兩個連續(xù)核苷酸（修飾或未修飾的）之 間的至少一個磷酸連接是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的寡核 苷酸是硫代磷酸酯。
[0024] 此外，本發(fā)明涉及TGF-β反義寡核苷酸，其與超過一種TGF-β同種型相互作用并 抑制其表達，即使在寡核苷酸與TGF- β 1、TGF- β 2和/或TGF- β 3序列非100%互補的情況 下也是如此。這類反義寡核苷酸分別是例如ASPH1024、ASPH1096、ASPH1131和ASPH1132。 這些寡核苷酸優(yōu)選與相同或不同物種（如人、猴、大鼠或小鼠）的TGF-β序列相互作用，例 如分別是ASPH1131 和ASPH1132。
[0025] 不同實施方式的所有寡核苷酸均用于預(yù)防和/或治療眼科疾病的方法，這些眼 科疾病是例如干眼病、青光眼、后囊膜混濁（PC0)、成視網(wǎng)膜細胞瘤、脈絡(luò)膜癌、馬凡或洛伊 斯-迪茨綜合征、黃斑變性（如衰老相關(guān)的黃斑變性、糖尿病黃斑水腫或白內(nèi)障）。
【附圖說明】
[0026]圖 1 顯示人 TGF-βImRNA 的核酸序列（ΝΜ_000660· 4)。
[0027]圖 2 顯示人 TGF-β 2mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003238· 3)。
[0028]圖 3 顯示人 TGF-β 3mRNA 的核酸序列（ΝΜ_003239· 2)。
[0029] 圖4顯示核苷酸修飾的示例。
[0030] 圖5a)至5c)顯示人Α172神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中TGF-β1和TGF-β2mRNA表達的抑 制。以10nM的劑量使用不同的修飾的寡核苷酸轉(zhuǎn)染A172細胞（在轉(zhuǎn)染試劑存在的情況 下），并在轉(zhuǎn)染后24小時測量TGF-β1 (白色柱）和TGF-β