一種快速提取和分離牡丹種子中脂類成分的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于木本植物油料作物領域，具體設及一種快速提取和分離牡丹種子中脂 類成分的方法，僅用少量種子就可W快速高效提取牡丹種子中的脂類成分，進一步分離得 到的總脂，并分析其中的組分及含量。
【背景技術】
[0002] 富貴吉祥的牡丹，素有"國花"的美譽，是中國傳統(tǒng)文化的重要組成部分，其根 皮可W入藥，其巧油富含不飽和脂肪酸尤其是a-亞麻酸（a-Iinolenicacid,ALA， 18:3&9'12'15)，使得牡丹兼具有觀賞、藥用和油用價值于一身。近年來，多不飽和脂肪酸的開 發(fā)已成為功能食品研究的熱點之一，而牡丹巧油中飽和脂肪酸含量很低，不飽和脂肪酸含 量非常高。若用牡丹巧油與常見食用油（ALA含量少）進行合理調(diào)配，開發(fā)營養(yǎng)合理且有保 健功能的調(diào)和油，將讓牡丹資源發(fā)揮更好的效益，擁有廣闊的應用前景。所W，作為新型資 源植物而迅速發(fā)展的油用牡丹產(chǎn)業(yè)，為緩解我國食用油危機、提升我國油用作物產(chǎn)業(yè)的品 質(zhì)內(nèi)涵帶來了新的機遇，同時也提出了新的科技挑戰(zhàn)。
[0003] 細胞中的脂肪酸主要通過醋化反應形成復合脂質(zhì)。甘油脂是脂肪酸與甘油 的醋化反應產(chǎn)物，包括膽存脂或膜脂，分為甘油憐脂（phospholipids,化)、甘油糖脂 (glycolipids，GL)和中性脂（neutrallipids,化），化和化也統(tǒng)稱為極性脂?；?括單酷甘油（monoa巧Iglycerol，MAG)、二酷甘油（dia巧Iglycerol，DAG)和S酷甘油 (tria巧Iglycerol，TAG),而TAG作為有機體能量的主要儲存方式。化和化是膜脂的 主要組分，化是細胞膜的骨架成分，分布于質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、線粒體、高爾基體和 核膜等，是細胞的基本結構成分，也是重要的信號分子或前體?；易逯饕☉z脂 酷膽堿（phosphatidylcholine,PC)、憐脂酸（phosphatidylacid,PA)、憐脂酷乙醇胺 (phosphatidylethanolamine，陽）、憐脂酷甘油（phosphatidylglycerol，PG)、憐脂酷肌 醇（phosphatidylinositol，PI)、憐脂酷絲氨酸（phosphatidylserine，PS)、溶血卵憐脂 (Iyso地OS地aticbdcholine,LPC)。PC在植物的甘油憐脂中最為普遍存在，并且PA和PC在 TAG形成中起關鍵作用，PC是脂肪酸去飽和及其他修飾的底物，并直接為DAG提供脂肪酸供 體形成TAG。另外，GL是葉綠體和類囊體膜的主要成分，在植物光合作用中至關重要，主要 包括單半乳糖二脂酷甘油（MGDG)、雙半乳糖二脂酷甘油值GDG)、硫代異鼠李糖二脂酷甘油 (SQDG)。
[0004] a-亞麻酸屬于0-3系列多不飽和脂肪酸，在人體內(nèi)不能合成、代謝，必須依靠 膳食來獲得，飲食中缺少《-3家族的脂肪酸會導致高血脂、屯、血管疾病、自身免疫疾病、炎 癥反應和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等W。FA0/WH0推薦飲食中CO-6與CO-3脂肪酸的比例應低 于5 (FA0&WH0, 1994)。普通食物中，魚油的ALA含量較高，但是環(huán)境污染日趨嚴重，加上漁 業(yè)資源的不合理捕拱，且素食主義者無法從魚油中補充《-3,故不能作為ALA的理想供給 者。因此，植物粋油，如油菜（8%)、大豆（7. 95%)、核桃化％)、橄攬油0). 73%)、油茶油 (0.54%)、玉米化51 %)、花生化08%)和葵花巧油化01%)等逐漸成為ALA的主要供 給原料。但是，運些大宗油料作物中ALA含量均很低。 陽0化]牡丹巧油中含有豐富的不飽和脂肪酸（約83. 05-90 % ) :ALA(>40% )、油酸 (27. 73% )、亞油酸（21. 4% )，運些都是對人體非常重要的脂肪酸，而且CO-6/CO-3脂肪酸 的比值很低，僅為0.6,運一比值遠遠低于其它食用油中CO-6/CO-3的比例，如菜巧油（~ 2. 4)、大豆油（~3. 9)、橄攬油（~16. 7)、玉米油（~100)、花生油巧81. 6)、葵花巧油（~ 670)，更為符合FA0/WH0推薦的飲食標準（CO-6/CO-3脂肪酸巧）。雖然紫蘇巧（Perilla frutescens)和亞麻巧(Xinumusitatissimum)中ALA含量較高，分別為54%和51%，但紫 蘇和亞麻屬于草本植物，在種子產(chǎn)量（畝產(chǎn)約190公斤和33-55公斤）和經(jīng)濟成本方面遠 不如木本作物的牡丹（畝產(chǎn)400-900公斤）。
[0006] 牡丹種子油的傳統(tǒng)的提取方法是索氏萃取，實驗室多采用脂肪提取器來提取，但 是該方法不僅需要樣品多且耗時長，一般需要幾個小時到十幾個小時。隨著植物巧油提取 技術的不斷改進，特別是索氏萃取、超臨界流體萃取技術及超聲波、微波萃取法的應用，極 大提高了植物巧油提取率，但是運些提取方法需要的樣品量多，對于稀缺資源的樣本來說 很難達到提取要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速提取和分離牡丹種子中脂類成分的方法，該方法 能夠快速、高效提取牡丹種子中的總脂，并對其中的不同脂類進行有效的分離，獲得的脂類 成分種類豐富，該方法快速、簡單且成本低，為基礎研究提供切實可行的分析方法。
[000引為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案如下：
[0009] 一種快速提取牡丹種子油脂的方法，包括W下步驟：
[0010] 1)提取總脂
[0011] 取牡丹種子，于30~60°C烘干、去殼、液氮研磨成粉末，將粉末用氯仿和甲醇的混 合液于30~40°C抽提0. 5~化，得到抽提液，再加入氯仿和水，振蕩混勻，靜置或離屯、后， 分層，分離出有機相；將提取后的剩余殘渣重復上述步驟1~2次，合并各次分離出的有機 相，用氮氣吹干，得到牡丹種子總脂；
[0012] 2)分離總脂中的中性脂、糖脂和憐脂
[0013] 用氯仿平衡硅膠柱，將得到的牡丹種子總脂上樣至硅膠柱中，先用氯仿洗脫，得到 氯仿洗脫液；再用丙酬洗脫，得到丙酬洗脫液；最后用甲醇洗脫，得到甲醇洗脫液；
[0014] 將氯仿洗脫液、丙酬洗脫液、甲醇洗脫液濃縮干燥后分別得到中性脂、糖脂、憐 脂；
[0015] 3)展開并分離中性脂、糖脂和憐脂中的不同成分
[0016] 將步驟。得到的中性脂、糖脂和憐脂溶解后，分別點樣于硅膠板上，將硅膠板置 于染缸中進行展開；
[0017] 用展示劑一對糖脂和憐脂進行展開、顯色、分離，其中，分離糖脂后得到單半乳糖 二脂酷甘油、雙半乳糖二脂酷甘油和硫代異鼠李糖二脂酷甘油；展開分離憐脂后得到憐脂 酷乙醇胺、憐脂酷膽堿、憐脂酸、憐醋酷絲氨酸、憐脂酷甘油；展示劑一為乙酸乙醋：異丙 醇：氯仿：甲醇：〇. 2%~0. 3%KCl水溶液的混合液，其中乙酸乙醋：異丙醇：氯仿：甲醇： 0. 2%~0. 3%KCl水溶液的體積比為 25:25:25:10:7. 2 ~10. 8 ;
[0018] 用展示劑二對中性脂進行展開、顯色、分離，得到=酷甘油；展示劑二為正己燒、乙 酸和冰乙酸的混合液，其中正己燒：乙酸：冰乙酸的體積比為40:10:0. 5~1. 5。
[0019] 進一步，步驟1)中氯仿和甲醇的混合液中氯仿和甲醇的體積比為1:1. 8~2. 2。
[0020] 又進一步，步驟1)中氯仿總量：甲醇：水的體積比為1:1:0. 85~0. 95。
[0021] 進一步，所述的步驟3)的顯色方法為：噴灑顯色劑后于120~140°C下烘干3~ 5min完成顯色，所述的顯色劑為8%的憐酸和10%的硫酸銅溶液。
[0022] 本發(fā)明建立了一種應用材料少、操作方法快速、簡單的提取分離牡丹種子油脂的 方法，抽提牡丹種子中的總脂時先加入液氮研磨，使得細胞完全破碎、物質(zhì)完全釋放，再利 用本發(fā)明的提取劑（氯仿、甲醇和水）抽提脂類成分，可W快速、完全將總脂提取出來，操作 方法快速、簡單，較傳統(tǒng)的索氏抽提節(jié)省75%的時間。
[0023] 本發(fā)明在提取牡丹種子總脂時將提取劑（氯仿、甲醇和水）分批加入，先用氯仿和 甲醇在30~40°C的水浴振蕩0. 5~化，快速有效地提取大部分牡丹種子的總脂，再分別加 入氯仿和水進一步提取，充分有效地提取牡丹種子中的各種脂類成分，增加了提取劑的體 積，利于有機相和水相的分層，提高牡丹種子中提取的總脂含量，本發(fā)明提取牡丹種子的總 脂含量可達33%W上，總脂中脂類成分的純度高，甲醋化后得到的脂肪酸含量高。
[0024] 經(jīng)過多次的摸索，本發(fā)明的展示劑一（乙酸乙醋：異丙醇：氯仿：甲醇：0. 2%~ 0. 3%KCl水溶液的體積比為25:25:25:10:7. 2~10. 8的混合液）、展示劑二（正己燒：乙 酸：冰乙酸的體積比為40:10:0. 5~1. 5的混合液）能夠最有效地將糖脂、憐脂和中性脂進 行分離，可W快速分離出其中的多種脂類成分。同時，對總脂、糖脂、憐脂和中性脂進行甲醋 化后得到脂肪酸，可W直接應用GC-MS檢測進行定性定量分析，快速、簡單且成本低，而且 牡丹種子材料用量少，脂類成分獲得率高，節(jié)約樣品。 陽0巧]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：
[00%] 1)本發(fā)明抽提牡丹種子中的總脂時先加入液氮研磨，使得細胞完全破碎、物質(zhì)完 全釋放，再分批加入本發(fā)明的提取劑（氯仿、甲醇和水）抽提脂類成分，可W快速、完全將總 脂提取出來，操作方法快速、簡單，較傳統(tǒng)的索氏抽提節(jié)省75%的時間。
[0027] 2)本發(fā)明通過改進洗脫液及展開劑的種類和配比濃度，快速、有效地分離牡丹種 子總脂中的不同脂類，適用范圍廣，最低僅需毫克級別的種子就可W提取到牡丹種子油脂， 并將不同脂類家族進行有效的分離。
[00測如本發(fā)明將提取牡丹種子得到的總脂、糖脂、憐脂和中性脂經(jīng)甲醋化后得到脂肪 酸，其中，來自中性脂的脂肪酸約占總脂肪酸的90. 2~91. 9% ;來自糖脂的脂肪酸約占總 脂肪酸的3. 2~3. 8% ;來自憐脂的脂肪酸約占總脂肪酸的5. 0~6. 0%，本發(fā)明為油料作 物的基礎科學研究提供技術指導和參考。
[0029] 4)本發(fā)明將提取牡丹種子得到的總脂進行分離，得到9種不同的脂類成分，大大 豐富了牡丹種子中提取到的脂類家族。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明實施例中提取牡丹種子的總脂和甲醋化后的總脂肪酸含量的比較 圖。
[0031] 圖2為本發(fā)明實施例中牡丹種子總脂展開后的不同脂類。
[0032] 圖3為本發(fā)明實施例中楊山牡丹成熟種子脂肪酸色譜圖。
[0033]圖4為本發(fā)明實施例中紫斑牡丹成熟種子脂肪酸色譜圖。
【具體實施方式】
[0034]W下結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。 陽0對 實施例
[0036] 1.材料
[0037] 楊山牡丹、紫斑牡丹種子分別采收于上海辰山植物園牡丹和巧藥基地。甲醇、濃硫 酸、=氯甲燒、正己燒、乙酸乙醋、異丙醇、乙酸、冰乙酸、丙酬等購自國藥集團化學試劑有限 公司，氣相色譜-質(zhì)譜用到的試劑均為色譜純級別；37種脂肪酸標準品購自Sigma;薄層色 譜硅膠板購自默克公司；棟色螺紋口頂空瓶、磁性金屬蓋（PTFE藍色硅膠隔墊）、CNW固