一株二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安 全免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 2, 6-二叔下基對甲酪（BHT)，是一種油溶性的有機化合物。它主要在食品添加劑 中被用作為抗氧化劑（E編碼為E321)，也在化妝品、藥物、飛機燃料、橡膠、石油制品和標(biāo)本 中有抗氧化作用。雖毒性較大，但其抗氧化能力較強，耐熱及穩(wěn)定性好，既沒有特異臭，也 沒有遇金屬離子呈色反應(yīng)等缺點，而且價格低廉，僅為抗氧化劑下基徑基茵香酸（BHA)的 1/5~1/8,我國仍作為主要抗氧化劑使用。一般與BHA配合使用，并W巧樣酸或其他有機 酸為增效劑。我國規(guī)定可用于食用油脂、油炸食品、餅干、方便面、速煮米、果仁罐頭、干魚制 品和騰臘肉制品，最大使用量0. 2g/kg。
[0003] 目前檢測二叔下基對甲酪的方法主要有氣相色譜法（GC)、液相色譜法（HPLC)、分 光光度法、電化學(xué)測定法、氣質(zhì)聯(lián)用法等方法，但是運些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較 貴等缺點，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的二叔下基對甲酪檢測 方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時 對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。然而得到高特異 性和高靈敏度的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株對二叔下基對甲酪具有較好特異性和檢測靈敏度的單 克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案，提供一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì) 胞株制備的抗體對二叔下基對甲酪具有較好特異性和檢測靈敏度，可W用來建立二叔下基 對甲酪的免疫學(xué)檢測方法。
[0006] 一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為2B2,已保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，分類命名為單克隆細(xì)胞株，保藏日期為2015年5 月19日，保藏編號為CGMCCNo. 10870。
[0007] 二叔下基對甲酪單克隆抗體，由所述保藏號為CGMCCNo. 10870的二叔下基對甲 酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2B2所分泌產(chǎn)生。 陽00引本發(fā)明提供的2B2細(xì)胞株的制備基本步驟為： (1)完全抗原的合成：稱取BHT類似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA)24. 8mg，碳 二亞胺（EDC) 38. 3mg，徑基班巧酷亞胺（畑S) 23.Omg，用1血無水DMF溶解(稱為A液)， 室溫攬拌反應(yīng)地。稱取牛血清白蛋白（BSA) 56mg溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中 (稱為B液)。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，得到偶聯(lián)物BHTA-BSA 混合液即為完全抗原，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收 掃描方法鑒定； (2) 小鼠的免疫：選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。二叔下基對甲酪完 全抗原BHTA-BSA與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次 免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之 間間隔21天。最后一次用二叔下基對甲酪完全抗原(不含佐劑)沖擊免疫；通過間接化ISA 檢測血清效價和抑制； (3) 細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000)法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤 細(xì)胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接化ISA檢測陽性細(xì)胞孔，并進一步利用間接競爭 ELISA法測定陽性細(xì)胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細(xì)胞孔進行= 次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株2B2 ; (4) 雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過化ISA法測定靈敏度和特異性。
[0009] 所述二叔下基對甲酪單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全中對二叔下基對甲酪的殘 留檢測。 陽010] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明獲得的抗二叔下基對甲酪單克隆抗體細(xì)胞株，對二叔 下基對甲酪有較好的檢測靈敏度和特異性（ICw值為8. 9yg/L)。
[0011] 生物材料樣品保藏：一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為 2B2,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為：北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為單克隆細(xì)胞株，保藏 日期為2015年5月19日，保藏編號為CGMCCNo. 10870。
【附圖說明】
[0012] 圖1 2B2單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi) 容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0014] 本發(fā)明通過將二叔下基對甲酪完全抗原免疫小鼠，通過細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng) 基培養(yǎng)，通過間接化ISA和間接競爭化ISA篩選細(xì)胞上清，最終得到了對二叔下基對甲酪有 較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
[0015] 實施例1雜交瘤細(xì)胞株2B2的制備 (1)完全抗原的合成：稱取BHT類似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA) 24. 8mg，EDC38. 3mg，N服23.Omg，用1血無水DMF溶解(稱為A液)，室溫攬拌反應(yīng)地。稱取BSA56mg 溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中（稱為B液)。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中， 室溫反應(yīng)過夜，得到偶聯(lián)物BHTA-BSA混合液即為完全抗原，通過透析分離完全抗原和未偶 聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定。
[0016] (2)動物免疫：選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取二叔下基對甲 酪完全抗原BHTA-BSA與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強 免之間間隔21天。S免后7天采血，使用間接競爭化ISA方法測定小鼠血清效價和抑制， 選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0017] (3)細(xì)胞融合：在沖擊免疫S天后，按照常規(guī)陽G(聚乙二醇，分子量為4000)方法 進行細(xì)胞融合，具體步驟如下： a、 無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，并進行細(xì)胞計數(shù)； b、 收集SP2/0細(xì)胞，懸浮于RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進行細(xì)胞計數(shù)； C、將脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照1 : 5的計數(shù)比例混合，離屯、后用50%PEG融合，時間1min,之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離屯、后懸浮于含20%胎牛血清、2%的 50XHAT的RPMI-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37°C、5% (?的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。
[0018] (4)細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合的第3天對融合細(xì)胞進行RPMI-1640篩 選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清、1%的IOOXHT的RPMI-1640過渡培養(yǎng)液 進行全換液，在第7天取細(xì)胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接化ISA篩選出陽 性細(xì)胞孔，第二步選用二叔下基對甲酪為標(biāo)準(zhǔn)品，用間接競爭化ISA對陽性細(xì)胞進行抑制 效果測定。選擇對二叔下基對甲酪標(biāo)準(zhǔn)品均有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進行亞 克隆，用同樣的方法進行檢測。重復(fù)=次，獲得細(xì)胞株2B2。
[0019] (5)單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟 油ImL;7天后每只小鼠腹腔注射1XIO6雜交瘤細(xì)胞，從第屯天開始收集腹水，將腹水通過 辛酸-硫酸錠法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0020] 使用間接競爭ELISA，測定單克隆抗體二叔下基對甲酪的ICso為：8. 9yg/L，說明 對二叔下基對甲酪有很好的靈敏度，可用于二叔下基對甲酪免疫分析檢測。 陽02U 實施例2抗體應(yīng)用 將雜交瘤細(xì)胞株2B2通過體內(nèi)腹水制備的單克隆抗體應(yīng)用于二叔下基對甲酪的快速 檢測，具體步驟如下： 曰、包被：將包被原BHTA-OVA用0. 05MpH9.6碳酸鹽緩沖液從2嗦/mL開始倍比稀釋， 10〇4 17孔，37°(：反應(yīng)化； b、洗涂：將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗涂液洗涂3次，每次3min; C、封閉：拍干后，加入200yL/孔封閉液，37°C反應(yīng)化，洗涂后烘干備用；t加樣：將抗血清從1:1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，IOOyL/ 孔，37°C反應(yīng)Ih;充分洗涂后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG, 100yL/孔，37°C反應(yīng) 比； e、 顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗涂后，每孔加入IOOiiL的TMB顯色液，37°C避光反應(yīng) ISmin; f、 終止和測定：每孔加入50M1 2MH2SO4終止液W終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測定各孔 的〇〇4日。值； 邑、結(jié)果判讀：W〇〇45。值大于或等于陰性對照孔的2. 1倍（即P/N> 2. 1)所對應(yīng)的血清 最高稀釋倍數(shù)即為血清的化ISA效價； 11、標(biāo)準(zhǔn)曲線：配置0、1、2、5、10、20、50和100^旨/16冊標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用間接競爭化15八 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其ICs。為8. 9yg/L。 陽0巧溶液的配置： 碳酸鹽緩沖液（CBS):稱取NazCOs1.59g，NaHC〇3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合， 加雙蒸水至約SOOmL混勻，調(diào)pH值至9. 6,加雙蒸水定容至1000 mL, 4°C膽存?zhèn)溆茫?憐酸鹽緩沖液（PBS):8.00g化Cl，0.2gKCl，0.2gKH2P04,2.9gNa2HP04?12H20， 溶于800血純水中，用化OH或肥1調(diào)抑到7. 2~7. 4,定容至1000血； PBST:含 0. 05% 吐溫 20 的PBS; TMB顯色液：A液：胞2冊〇4 ? 12&0 18. 43g，巧樣酸9. 33g，純水定容至1000血；B液： 60mgTMB溶于100血乙二醇中；A、B液按體積比1:5混合即為TMB顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。
[0023] 2B2單克隆抗體的交叉反應(yīng)率如表1所示。
[0024] 表1. 2B2單克隆抗體的交叉反應(yīng)率
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本 發(fā)明申請范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應(yīng)為本發(fā)明的技術(shù)范疇。
【主權(quán)項】
1. 一株二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其命名為2B2,已保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 10870。2. 二叔丁基對甲酚單克隆抗體，其特征在于：由所述保藏號為CGMCCNo. 10870的二 叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2B2所分泌產(chǎn)生。3. 權(quán)利要求2所述的二叔丁基對甲酚單克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于：用于食品安全 中對二叔丁基對甲酚的殘留檢測。
【專利摘要】一株二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2B2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.10870。二叔丁基對甲酚單克隆抗體，由所述保藏編號為CGMCC？No.10870的雜交瘤細(xì)胞株2B2所分泌產(chǎn)生，此細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，對二叔丁基對甲酚具有較好的特異性和檢測靈敏度IC50值為8.9μg/L，可以用于食品安全中二叔丁基對甲酚的殘留檢測。CGMCC No.1087020150919
【IPC分類】C07K16/44, C12R1/91, C12N5/20, G01N33/577
【公開號】CN105296436
【申請?zhí)枴緾N201510798015
【發(fā)明人】劉麗強, 孫成, 胥傳來, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月19日