用于檢測女性原發(fā)不孕的VIII型β-微管蛋白基因及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測女性原發(fā)不孕的VIII型 β-微管蛋白基因及試劑盒。VIII型β-微管蛋白基因突變是導(dǎo)致女性原發(fā)不孕的原因。通 過檢測此基因是否發(fā)生突變，可用來對(duì)不孕癥進(jìn)行診斷及判斷，并對(duì)病人后續(xù)進(jìn)行試管嬰 兒，選擇IVF/ICSI的方法或結(jié)局進(jìn)行指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002] 正常懷孕及生殖是維持及延續(xù)人類種群的重要環(huán)節(jié)。臨床中，AZF基因的微缺 失檢測已經(jīng)被廣泛用于男性不育患者的診斷中（PryorJLetal,Microdeletionsin theYchromosomeofinfertilemen.NEnglJMed. 1997Feb20; 336 (8) ; 534-9)〇 在研究方面，目前已經(jīng)有ZP-1，Stag3,FSHR等基因被發(fā)現(xiàn)與女性不孕癥密切相關(guān) (HuangHLetal,MutantZP1infamilialinfertility.NEnglJMed. 2014 370(13):1220-6;deRouxNetal,Afamilywithhypogonadotropichypogonadismand mutationsinthegonadotropin-releasinghormonereceptor.NEnglJMed. 1997 337(22):1597-602;CaburetSetal,Mutantcohesioninprematureovarianfailure. NEnglJMed. 2014 370(10) :943-9)。但是，均未在臨床中應(yīng)用。
[0003] 導(dǎo)致女性不孕癥的原因很多，有一些臨床報(bào)道涉及以卵子不成熟為 特征的女性不孕癥的描述（Rudaketal,fertilityandsterility, 1990 54:292-296;HumanReproduction, 1995 10:2343-2349;fertilityandsterility1999 71:567-570;HumanReproduction2001 16 (10):2136-2138;HumanReproduction2002 17(6) :1604-1609;HumanR印roduction2002 17(10) :2556-2559)。這些病人通過反復(fù)進(jìn) 行授精-胚胎移植術(shù)(試管嬰兒)，均因未能獲取到成熟卵細(xì)胞，而無法完成成功的體外授精 操作。如果能發(fā)現(xiàn)相關(guān)致病基因，則對(duì)疾病臨床診斷及分型都具有重要意義。但是，目前還 未有以卵子不成熟導(dǎo)致的女性不孕癥的基因被發(fā)現(xiàn)。
[0004]VIII型β-微管蛋白基因（Tubulin，beta8classVIII，TUBB8)屬于編碼微管蛋 白家族9個(gè)成員之一。微管蛋白家族的其他基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)精神類疾病中發(fā)揮重 要作用。但是，VIII型β-微管蛋白基因的功能及與女性不孕的關(guān)系至今未知。
[0005] 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，至今未見關(guān)于TUBB8基因的任何報(bào)道。也未發(fā)現(xiàn) 其與女性不孕癥相關(guān)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種操作方便、效果明確的用于檢測女性原發(fā)不孕的VIII 型β-微管蛋白基因及檢測該基因突變的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供的用于檢測女性原發(fā)不孕的VIII型β-微管蛋白基因（TUBB8)的核酸 序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明涉及篩查因卵子不成熟而致原發(fā)性不孕的方法，就是通過檢測TUBBS基因 是否發(fā)生突變來判斷病人是否為卵子不成熟而導(dǎo)致的原發(fā)性不孕。從患者的外周血中提取 DNA后，用PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）法結(jié)合DNA測序，來檢測TUBB8基因是否發(fā)生了突變。
[0009] 本發(fā)明涉及檢測TUBB8基因是否發(fā)生突變的引物。
[0010]檢測TUBB8基因是否發(fā)生突變的方法如下：TUBB8有四個(gè)外顯子。對(duì)其中1-3號(hào) 外顯子，利用引物對(duì)： 5' -AGTTCCCAGAGGATGACCTTAGCA-3'（SEQIDN0.2)， 5' -GCTATTTAAACGTTGGCGGAGG-3'（SEQIDNO. 3)， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件：92°C2分鐘，92°C30秒，57°C1分鐘，72°C3秒(此三步重 復(fù)35個(gè)循環(huán))，72°C10分鐘)，然后利用相同的引物進(jìn)行測序，與UCSC中TUBB8的標(biāo)準(zhǔn)序 列（SEQIDNO. 1)進(jìn)行比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)突變； 對(duì)其中第4號(hào)外顯子，利用引物對(duì)： 5' -ACCAGGAGACCATCACACAG-3'（SEQIDN0.4)， 5' -CGCTCAATCTGCCTCTCCTA-3'（SEQIDNO. 5)， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增條件：92°C2分鐘，92°C30秒，61°C1分鐘，72°C3秒(此三步重 復(fù)35個(gè)循環(huán))，72°C10分鐘；然后利用引物對(duì)： 5' -AACGCAGCAGGAGATGTGAA-3'（SEQIDN0.6)， 5' -CCCTGCAAGAACCTGAGCTG-3'(SEQIDNO. 7), 進(jìn)行測序，再與UCSC中TUBB8的標(biāo)準(zhǔn)序列（SEQIDNO. 1)進(jìn)行比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)突變。通 過PCR及一代測序，及與標(biāo)準(zhǔn)序列的比對(duì)，來檢測TUBB8基因是否發(fā)生突變。
[0011] 本發(fā)明還提供一種檢測卵子不成熟致原發(fā)性不孕的篩查試劑盒。此試劑盒可以 指導(dǎo)醫(yī)生對(duì)疾病病因的判斷、對(duì)疾病進(jìn)行正確分類，從而告知患者采用IVF法還是ICSI法 進(jìn)行試管嬰兒操作，以及是否適合繼續(xù)施行體外授精-胚胎移植術(shù)（IVF)或單精子注射術(shù) (ICSI)(試管嬰兒)。
[0012] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述擴(kuò)增TUBB8的1-4號(hào)外顯子的擴(kuò)增引物及測序引 物（SEQIDNO. 2-SEQIDN0. 7)及反應(yīng)混合液；反應(yīng)混合液包括DNA聚合酶、dNTP及緩沖 液； 具體使用方法為：將引物用水稀釋為10uM濃度的工作液。反應(yīng)體系為10ul，其中，lul樣本DNA，0. 5ul正向引物，0. 5ul反向引物，5ul反應(yīng)混合液及3ul的水組成?；旌虾?，按上 述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，而后進(jìn)行一代測序。
[0013] 本發(fā)明還提供用于研究藥物治療卵子不成熟致原發(fā)性不孕的基因修復(fù)靶位點(diǎn)（即 實(shí)際檢測出的病人的突變位點(diǎn)，比如在表1中列出了 7個(gè)突變位點(diǎn)，實(shí)際檢測過程中，通過 與標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，可能會(huì)存在新的突變位點(diǎn))，并通過對(duì)靶位點(diǎn)的修復(fù)，從而使得TUBB8可以 行使正常功能，進(jìn)而可以治療此種疾病。
[0014] 本發(fā)明還可通過檢測TUBB8基因的突變，指導(dǎo)臨床具有此基因突變的病人，應(yīng)采 用哪種手術(shù)方法（IVF或ICSI)進(jìn)行試管嬰兒術(shù)。常規(guī)臨床中，夫婦希望進(jìn)行試管嬰兒時(shí)， 如果男方不是嚴(yán)重少弱精，一般首先采用IVF的方法進(jìn)行試管嬰兒術(shù)。但是，如果病人通過 檢測發(fā)現(xiàn)具有TUBB8的突變，那么對(duì)此病人應(yīng)當(dāng)直接采用ICSI進(jìn)行試管嬰兒術(shù)。因?yàn)椋?有此突變的病人的卵子是不成熟的，所以應(yīng)采用ICSI方法，對(duì)獲得的卵子進(jìn)行體外成熟培 養(yǎng)嘗試，而不應(yīng)采用IVF。
【附圖說明】
[0015] 圖1為病人突變?yōu)樵赥UBB8結(jié)構(gòu)上的分布展示。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0017] 實(shí)施例1:樣本的收集和外周血DNA的抽提 卵子不成熟致原發(fā)性不孕患者來自于中國上海復(fù)旦大學(xué)附屬紅房子醫(yī)院上海集愛遺 傳與不育診療中心、中國上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院生殖中心。診斷標(biāo)準(zhǔn)由RudakE 等人（RudakE. ,DorJ. ,KimchiM. ,GoldmanB. ,LevranDandMashiachS,Anomalies ofhumanoocytesfrominfertilewomenundergoingtreatmentbyinvitro fertilization.FertilSteril. 1990Aug; 54(2) :292-6)提出D 男方精液檢查正常，女方 患者雌性生殖器官、卵巢功能、性激素均正常，2次以上促排周期每次取到5個(gè)以上卵子，均 未有可見第一極體形態(tài)。在知情同意的前提下參加本課題的研究，采集血液，并簽署知情同 意書。所有入組患者均通過病史排除其他生殖內(nèi)分泌疾病。本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照人群為1000個(gè) 生育功能正常的女性，取樣本血液300U1，按試劑盒說明書提取DNA，用紫外分光光度儀檢 測DNA濃度和純度。
[0018] 實(shí)施例2:檢測TUBB8基因的突變 本發(fā)明采用PCR結(jié)合測序進(jìn)行TUBB8基因突變的尋找。其原理是先對(duì)TUBB8基因的 四個(gè)外顯子進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(可具體給出引物序列)及擴(kuò)增，進(jìn)行TUBB8基因突變的尋找。（即 將DNA樣本與反應(yīng)工作液（DNA聚合酶、dNTP，水及緩沖液）混合后混勻，依照PCR程序進(jìn)行 擴(kuò)增。所得產(chǎn)物，經(jīng)過純化及進(jìn)一步測序反應(yīng)，在ABI3730測序上測序。結(jié)果分析通過HLA Fusion軟件（Onelambda,CA,USA,HLAFusion3.0)進(jìn)行。擴(kuò)增 1-3 號(hào)外顯子的PCR 引物為：
[0019] 實(shí)施例3:TUBB8基因突變與因卵子不成熟而致原發(fā)性不孕 結(jié)果：我們共搜集到TUBB8基因突變所致因卵子不成熟而致原發(fā)不孕患者7例。相應(yīng) 突變位點(diǎn)信息見下表(表1)。突變位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上的分布見圖1所示。
[0020] 表1病人TUBB8基因突變信息
綜上所述，本發(fā)明的具有如下重要實(shí)際意義： (1) 可以利用本發(fā)明提出的TUBB8基因作為預(yù)測因卵子不成熟致女性不孕的標(biāo)記基 因； (2) 利用本發(fā)明提供的TUBB8基因可用于評(píng)價(jià)或制備因卵子不成熟致女性不孕的篩查 試劑盒； (3) 利用本發(fā)明提供的TUBB8基因可用于指導(dǎo)臨床具有此基因突變的病人，應(yīng)采用哪 種手術(shù)方法（IVF或ICSI)進(jìn)行試管嬰兒術(shù)。
[0021]所述SEQIDN0.1: (a) 序列特征： 長度：1335堿基對(duì) 類型：核酸 鏈型：雙鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線形 (b) 分子類型：cDNA (c) 假設(shè)：否 ⑷反義：否 (e) 最初來源：人 (f) SEQIDNO. 1核酸序列如下：

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測女性原發(fā)不孕的VIII型β-微管蛋白基因（TUBB8)，其核酸序列如SEQID NO. 1所示。2. 用于檢測TUBB8基因是否發(fā)生突變的引物，其特征在于，對(duì)于TUBB8基因的四個(gè)外顯 子，用于檢測第1-3號(hào)外顯子的PCR擴(kuò)增引物對(duì)為： 5' -AGTTCCCAGAGGATGACCTTAGCA-3' ， 5' -GCTATTTAAACGTTGGCGGAGG-3'， 測序引物對(duì)同上； 用于檢測第4號(hào)外顯子的PCR擴(kuò)增引物對(duì)為： 5' -ACCAGGAGACCATCACACAG-3' ， 5' -CGCTCAATCTGCCTCTCCTA-3'， 測序引物對(duì)為： 5' -AACGCAGCAGGAGATGTGAA-3， 5' -CCCTGCAAGAACCTGAGCTG-3'。3. 用于檢測TUBB8基因是否發(fā)生突變的方法，其特征在于具體步驟如下： TUBB8有四個(gè)外顯子，對(duì)其中第1-3號(hào)外顯子，利用引物對(duì)： 5' -AGTTCCCAGAGGATGACCTTAGCA-3' ， 5' -GCTATTTAAACGTTGGCGGAGG-3'， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用相同的引物進(jìn)行測序，與UCSC中TUBB8的標(biāo)準(zhǔn)序列SEQID NO. 1進(jìn)行比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)突變； 對(duì)其中第4號(hào)外顯子，利用引物對(duì)： 5' -ACCAGGAGACCATCACACAG-3' ， 5' -CGCTCAATCTGCCTCTCCTA-3' ， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；然后利用引物對(duì)： 5' -AACGCAGCAGGAGATGTGAA-3，， 5' -CCCTGCAAGAACCTGAGCTG-3' ， 進(jìn)行測序，再與UCSC中TUBB8的標(biāo)準(zhǔn)序列SEQIDNO. 1進(jìn)行比對(duì)，從而發(fā)現(xiàn)突變。4. 一種用于檢測卵子不成熟致原發(fā)性不孕的篩查試劑盒，其特征在于試劑盒包括上 述擴(kuò)增TUBB8基因的1-4號(hào)外顯子的擴(kuò)增引物及測序引物：SEQIDNO. 2-SEQIDNO. 7及 反應(yīng)混合液；反應(yīng)混合液包括DNA聚合酶、dNTP及緩沖液。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為用于檢測女性原發(fā)不孕的VIII型？-微管蛋白基因及試劑盒。本發(fā)明涉及的人類微管蛋白基因-VIII型？-微管蛋白基因：TUBB8基因，它的突變時(shí)是導(dǎo)致因卵子不成熟致女性不孕的原因。通過檢測TUBB8基因的突變可作為判斷因卵子不成熟致女性不孕的標(biāo)記基因。利用本發(fā)明提供的TUBB8基因可用于評(píng)價(jià)或制備因卵子不成熟致女性不孕的篩查試劑盒。利用本發(fā)明提供的TUBB8基因可用于指導(dǎo)臨床相應(yīng)患者進(jìn)行試管嬰兒術(shù)時(shí)的操作方法；利用本發(fā)明提供的TUBB8基因可用于評(píng)價(jià)或制備IVF/ICSI有效性的篩查試劑盒。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/12
【公開號(hào)】CN105296634
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510755090
【發(fā)明人】王磊, 馮睿芝, 桑慶, 胥堯
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月9日