專利名稱：雄性不育基因tcl 、編碼的蛋白及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基因、編碼的蛋白及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì) 胞，具體涉及一種雄性不育基因TCL、編碼的蛋白及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
水稻是我國最主要的糧食作物之一，我國有60%以上人口以稻米為主食，是世界 上最大的稻米生產(chǎn)國和消費(fèi)國。我國水稻年播種面積3000萬公頃，占世界的20% ；產(chǎn)量 1. 85億噸，占世界的近1/3，單位面積產(chǎn)量6. 35噸/公頃，比全球平均產(chǎn)量3. 85噸/公頃高 65%。水稻在我國谷物產(chǎn)量中始終保持在總量的40%左右，占據(jù)了近半壁江山，其中一個(gè)重 要的原因就是水稻雄性不育系的發(fā)明與雜種優(yōu)勢(shì)的廣泛應(yīng)用發(fā)揮了舉足輕重的作用。生物 界不同遺傳背景的親本配組所產(chǎn)生的F1代都比其父母代具有更強(qiáng)的生長勢(shì)和抗逆性，這 就是雜種優(yōu)勢(shì)。作物雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高作物產(chǎn)量的重要途徑，雜交水稻的推廣應(yīng)用，為中 國乃至世界的糧食增產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)，而作物雄性不育系是有效利用雜種優(yōu)勢(shì)的前提和 基礎(chǔ)。利用水稻雄性不育系生產(chǎn)雜交種子，使水稻的雜種優(yōu)勢(shì)在生產(chǎn)上得以廣泛應(yīng)用才成 為可能。因此，研究選育新型水稻雄性不育系并對(duì)其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究，是進(jìn)一步發(fā)掘 水稻優(yōu)質(zhì)和超高產(chǎn)品種必要前提和基礎(chǔ)。水稻雄性器官花藥的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到花藥細(xì)胞的分裂分化，花粉 母細(xì)胞的減數(shù)分裂和花粉的有絲分裂等發(fā)育過程，任何發(fā)育過程的異常都可影響花粉的正 常發(fā)育。絨粘層是花藥壁細(xì)胞中的最內(nèi)層細(xì)胞，與花粉母細(xì)胞和小孢子直接接觸，該層細(xì)胞 是花藥各層細(xì)胞中代謝最活躍和旺盛的一層細(xì)胞。在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂完成以后，絨 氈層細(xì)胞通過程序性死亡的方式開始降解，并為小孢子的進(jìn)一步發(fā)育和成熟合成和分泌大 量的營養(yǎng)物質(zhì)及外壁組成成份，因此該層細(xì)胞的死亡是形成成熟和可育花粉粒的基礎(chǔ)。另 一方面，絨氈層的降解與花粉外壁的正常形成存在著相互依賴，密不可分的一種關(guān)系?，F(xiàn)有 的轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)是建立在對(duì)植物正常發(fā)育過程分子調(diào)控機(jī)制充分研究和認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上 加以應(yīng)用的，因此，深入研究水稻絨氈層發(fā)育及小孢子成熟過程、分子調(diào)控機(jī)理及調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 并加以應(yīng)用是在生產(chǎn)上研發(fā)新型雄性不育株系的基礎(chǔ)。阻礙絨氈層細(xì)胞的死亡及小孢子外 壁正常發(fā)育是培育水稻雄性不育株系的有效途徑。但是目前對(duì)水稻絨氈層發(fā)育的分子調(diào)控 網(wǎng)絡(luò)以及花粉外壁組成成份及其分子調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)還不清楚。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，至今沒有發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的雄性不育基因TCL、編碼 的蛋白及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞有關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雄性不育基因TCL、編碼的蛋白 及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的TCL基因?yàn)榛ㄋ幪禺愋员磉_(dá)基因，該基因具有維持水 稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的功能，該基因功能的缺失導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞發(fā)生壞死，繼而 影響花粉及其外壁的發(fā)育，導(dǎo)致水稻的雄性不育。
本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的第一方面，本發(fā)明涉及一種雄性不育基因TCL，該基因編碼如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有影響 絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所示。第二方面，本發(fā)明還涉及一種啟動(dòng)所述基因表達(dá)的啟動(dòng)子，其堿基序列如SEQ ID NO 3所示。第三方面，本發(fā)明還涉及前述的水稻雄性不育基因TCL編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì) 的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。第四方面，本發(fā)明還涉及一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含堿基序列如SEQ ID NO :1所示的基 因。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒還包含堿基序列如SEQ ID NO 3所示的啟動(dòng)子。第五方面，本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含堿基序列如SEQ ID NO 1 所示的基因。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞還包含堿基序列如SEQ ID NO 3所示的啟動(dòng)子。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明在發(fā)掘和利用水稻小孢子 早期絨氈層的程序性死亡對(duì)花粉及其外壁、育性方面具有重要作用，可以通過基因敲除或 抑制TCL基因?qū)е陆q氈層細(xì)胞的異常死亡獲得新的水稻雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。


圖Itcl突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察示意圖；圖2tcl突變體花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡信號(hào)檢測示意圖；圖3TCL座位定位示意圖；圖4tcl互補(bǔ)植株的形態(tài)學(xué)觀察圖；圖5tcl突變體和野生型9522花藥組織切片示意圖；圖6TCL啟動(dòng)子活性分析圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用 于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。術(shù)語“編碼影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的蛋白的基因”指編碼具有調(diào)控花粉 外壁角質(zhì)單體合成的單氧酶活性多肽的核苷酸序列，如堿基序列如SEQ ID NO :1中第1 2040位所示的核苷酸序列及其簡并序列。簡并序列是指，位于SEQ ID NO :1序列的編碼框 第1 2040位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO :1中第1 2040位核苷酸序列同源 性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO :2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán) 緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO :1中從核苷酸第1 2040位的核苷酸序 列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID N0:1中從核苷酸第1 2040位的核苷酸 序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序 列。該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的相同功能的 蛋白的SEQ ID NO :1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于) 若干個(gè)(通常為1 90個(gè)，較佳地1 60個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最佳地1 10個(gè))核苷 酸的缺失、插入和/或取代，以及在5梂？或3挾頌砑郵？通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30 個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。術(shù)語“影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的蛋白”指具有調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì)胞 程序性死亡蛋白活性的SEQ ID NO :2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然調(diào)控水稻花藥 絨氈層細(xì)胞程序性死亡的PHD finger蛋白SEQ ID NO :2序列的變異形式。這些變異形式 包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1 50個(gè)，較佳地1 30個(gè)，更佳地1 20個(gè)，最 佳地1 10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或 數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。在本領(lǐng)域中， 用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；在C末端和/或N末 端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。實(shí)施例中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生 產(chǎn)本實(shí)施例的水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡相關(guān)多肽時(shí)，可以將調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì) 胞程序性死亡蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成調(diào)控水稻花藥絨氈層細(xì) 胞程序性死亡相關(guān)蛋白表達(dá)載體。術(shù)語“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一 線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那 么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄， 那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么 它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意 味著在閱讀框中相鄰。術(shù)語“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞，常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、水稻細(xì)胞和其 它植物細(xì)胞。相關(guān)核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法 獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列 來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作 為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將 各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大 批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后 的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。除了用重組法產(chǎn)生之外，實(shí)施例中蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽 而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行?？梢苑謩e化學(xué)合成本實(shí)施例蛋白
5的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。術(shù)語“啟動(dòng)子”指為RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。在DNA指 導(dǎo)下RNA的合成稱為轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的起始由DNA的啟動(dòng)子控制。實(shí)施例是利用γ射線對(duì)粳稻9522品系進(jìn)行處理，種植后在F2代挑選花藥發(fā)育異 常的突變體，挑選分離比為3 1的隱性單基因突變體為研究對(duì)象。獲得一新的水稻隱性雄 性不育突變體tcl。通過遺傳定位方法，首先將突變基因座位定位在水稻第9染色體InDel 標(biāo)記Ch901和Lh901之間。進(jìn)一步精細(xì)定位，我們?cè)谶@兩個(gè)標(biāo)記之間發(fā)展了 5對(duì)有多態(tài)性 InDel分子標(biāo)記，將該基因座位定位在Lh903_8和Lh903_5之間，物理距離為63. 6kb。該區(qū) 域包含7個(gè)編碼基因，其中一個(gè)編碼PHD finger蛋白的基因與擬南芥雄性不育基因MSl同 源，通過對(duì)該基因的兩次測序，發(fā)現(xiàn)突變體tcl該基因的第二個(gè)內(nèi)含子處有一個(gè)T堿基的插 入，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分析確定雄性不育基因TCL的功能異常造成了水稻花粉的不育。通 過對(duì)花藥不育突變體tcl花器官發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行組織切片、掃描電鏡、染色體觀察，發(fā)現(xiàn)該 基因的突變會(huì)導(dǎo)致水稻小孢子從四分體中釋放出來后，絨氈層細(xì)胞無PCD信號(hào)，小孢子中 期絨氈層細(xì)胞逐漸膨大，且絨氈層細(xì)胞內(nèi)容物被滲透至花藥腔中，小孢子開始降解，成熟花 藥中無花粉粒；通過啟動(dòng)子加分子標(biāo)記GUS分析表明TCL基因在小孢子早期的絨氈層和小 孢子中表達(dá)；RT-PCR也表明TCL基因在花藥中特異性表達(dá)，在根、莖、葉及內(nèi)外稃中均不表 達(dá)；生化測定分析表明突變體花藥表面蠟質(zhì)成份增加；互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示TCL基因可以恢復(fù)突 變體的表型。說明該基因功能確實(shí)是影響到水稻的花粉發(fā)育，這種影響可能是通過調(diào)節(jié)花 藥絨氈層細(xì)胞的程序性死亡來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例1tcl突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)的觀察用6tlCo γ射線誘變粳稻9522種子，處理劑量為280Gy，得突變體。對(duì)誘變的F2代 中一雄性不育突變體三代回交，獲得隱性單基因調(diào)控的穩(wěn)定遺傳的突變體tcl。所有植物材 料種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。tcl突變體與粳稻9522回交，F(xiàn)l代全部為可育，自 交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為189，突變株為55 ( χ 2 = 0. 65)，表明該雄性不育突變 體表型由一個(gè)單核基因突變?cè)斐?。?duì)tcl突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察。如圖1，野生型和突變 型tcl的表型對(duì)比顯示野生型稻穗結(jié)實(shí)后下垂(左)，而tcl突變型小穗不結(jié)實(shí)呈直立狀 (右)，野生型花藥包含成熟花粉呈現(xiàn)為黃色(左)(B，C)，突變型tcl花藥為淡黃色且無花 粉粒(右)(B，C)。實(shí)施例2tcl突變體花藥絨氈層細(xì)胞的程序性死亡信號(hào)檢測步驟一，各發(fā)育階段野生型和突變體tcl花藥的石蠟切片制備(1)將所需材料適量(不超過固定液體積的1/20)取到已盛有FAA固定液的青霉 素小瓶中。用真空泵緩慢抽氣(抽氣過程10分鐘)，在真空狀態(tài)(> 20atm)放置15分鐘 后，緩慢放氣(放氣過程10分鐘)?？捎^察到有空氣小泡冒出，樣品沉到瓶底，4°C保存；(2)脫水；梯度分別為50%乙醇(植物組織沉在瓶底說明抽氣是充分的)，50% 乙醇，60%乙醇，70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，100%乙醇，1/4 二甲苯3/4乙 醇，1/2 二甲苯1/2乙醇，3/4 二甲苯1/4乙醇，室溫下每級(jí)30分鐘。90%二甲苯10%氯仿， 90 % 二甲苯10 %氯仿，90 % 二甲苯10 %氯仿，室溫下每級(jí)60分鐘，最后將90 % 二甲苯10 %氯仿裝滿青霉素小瓶體積的一半；(3)將3 5片蠟片小心投入含1/2體積90%二甲苯10%氯仿的樣品小瓶，并將 小瓶放置于已調(diào)到42°C的烘箱中，大約15分鐘后蠟溶解，輕輕搖動(dòng)小瓶，使溶解的石蠟均 勻分布，再加入3 5片蠟片。幾次后小瓶漸滿，保持30分鐘后，將材料用鑷子迅速轉(zhuǎn)入已 放有融好的蠟片(在60°C的烘箱上)的新青霉素小瓶中，過夜。每天早晚各換蠟1次，滲蠟 最好2 3天時(shí)間；(4)包埋；將溶好的石蠟到入折好的小船中，用燒熱的鑷子將材料夾到小船內(nèi)，并 擺好位置。待表面的蠟稍凝，將小船迅速浸于已備好的冷水中，放置至少2小時(shí)。包埋好的 蠟塊晾干后可用干凈容器裝好置于4°C存放；(5)預(yù)先打開烘箱45 50°C，將載玻片架子用一次性手套包好，放入烘箱里。打 開展片機(jī)42°C，預(yù)熱載玻片上的水(每片加水2 3ml)。先大致修塊，再精細(xì)修塊，切片厚 度8 10微米。42°C展片，吸干時(shí)使用無塵拭紙。42°C展1分鐘即可。展好后的片子放入 45 50°C的烘箱內(nèi)的玻片架子上，用一次性手套包好，以免污染，烤片24小時(shí)以上。步驟二，切片預(yù)處理切片預(yù)處理和P⑶信號(hào)檢測的方法來源于Promega公司的細(xì)胞凋亡檢測產(chǎn)品試劑 盒(017959)提供的實(shí)驗(yàn)步驟內(nèi)容，按公司提供的方法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)步驟如下切片脫蠟，將切片浸入新鮮100%二甲苯5min，重復(fù)一次；100 % 乙醇洗滌 5min ；乙醇梯度脫水，100%、95%、85%、70%、50%各級(jí) 3min ；0. 85% NaCl 中洗滌 5min ；PBS 洗滌 5min;將37%的甲醛溶液用PBS稀釋至3. 7%，將切片浸入，固定材料15min ；PBS洗滌兩次，每次5min ；吸去多余水分，將切片放置在平整桌面上；每片加上100 μ L 20 μ g/mL的蛋白酶K 將花藥組織覆蓋；孵育8 IOmin ；(注蛋白酶K幫助后續(xù)步驟中染色劑滲入組織細(xì)胞；為 了最佳效果，應(yīng)當(dāng)選擇最適孵育時(shí)間；4 6μπι厚的切片可以適當(dāng)延長時(shí)間；但是，延長時(shí) 間可能導(dǎo)致在后續(xù)洗滌步驟中使材料從玻片上脫落下來；)PBS 洗滌 5min ；3.7%甲醛的？85溶液中固定511^11;PBS洗滌5min ；(此時(shí)應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)備DNasel處理的正對(duì)照)步驟三，絨氈層P⑶信號(hào)的檢測輕拍玻片以去掉多余水分，覆以100 μ L平衡緩沖液，室溫下平衡5 IOmin ；在平衡過程中，按照每張切片45 μ L平衡緩沖液，5 μ L Nucleotide Mix和 1 μ LrTdT酶準(zhǔn)備rTdT孵育緩沖液；注應(yīng)將rTdT孵育緩沖液置于冰上，并避光；負(fù)對(duì)照準(zhǔn)備一份無rTdT酶的孵育緩沖液，包括45 μ L平衡緩沖液、5 μ L NucleotideMix和1 μ L去離子水；按照步驟3 12處理負(fù)對(duì)照切片；正對(duì)照加100 μ L DNase I緩沖液室溫下孵育5min ；輕拍去水分，加100 μ L含有 5. 5 lOunits/mL的DNase I的酶緩沖液，室溫下孵育IOmin ；去除多余水分，在充足的去 離子水中洗滌3 4次；按照步驟1 12處理正對(duì)照切片；
注=DNase I處理細(xì)胞會(huì)使染色體DNA片段化，并暴露出大量的可供標(biāo)記的3’_0H ； 應(yīng)當(dāng)使用另外一個(gè)染色缸處理正對(duì)照切片，因?yàn)闅埩舻腄Nase I的活性會(huì)給實(shí)驗(yàn)組引入強(qiáng) 烈的背景；在5cm2平衡 區(qū)域加50 μ L rTdT孵育緩沖液，不要讓細(xì)胞干燥；塑料覆膜可以剪半 使用，將邊緣折起便于移除；用塑料覆膜將細(xì)胞覆蓋使得反應(yīng)試劑均勻分布；在濕盒底部放入足量吸水紙，力口 水至過飽和；將切片在濕盒內(nèi)37°C孵育60min，使末端反應(yīng)進(jìn)行；用鋁箔把濕盒包裹起來避 免光直射；用去離子水把20XSSC按1 10稀釋為2XSSC，倒入染色缸；揭去塑料覆膜，將 切片浸入SSC中15min以終止反應(yīng)；(注SSC在使用前必須確保所有的鹽都已溶解)PBS洗滌三次，每次5min，將未結(jié)合的熒光12_dUTP洗去；將碘化丙啶(PI)在PBS中稀釋至終濃度1 μ g/mL,倒入染色缸中；將切片放入，黑 暗中染色I(xiàn)Omin ；去離子水洗滌三次，每次5min ；甩去多余水分，用吸水紙將細(xì)胞周邊水分吸去；在載玻片上滴一滴抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片；用潔凈的指甲油封住蓋玻片四周，晾干5 IOmin ；必要時(shí)，將玻片置于濕盒內(nèi)4°C黑暗中過夜保存；在520士20nm下觀察綠色熒光， 在> 620nm下觀察PI的紅色熒光(注PI將凋亡細(xì)胞和非凋亡細(xì)胞均染成紅色；熒光 12-dUTP則只結(jié)合在凋亡細(xì)胞的核內(nèi))。圖2中，A至D為野生型9522花藥細(xì)胞的P⑶信號(hào)檢測；A，第6發(fā)育階段的花藥 細(xì)胞中無任何PCD信號(hào)；第8發(fā)育階段的花藥(圖2B)、第9發(fā)育階段的花藥(圖2C)和第 10發(fā)育階段的花藥(圖2D)中都能檢測到PCD的信號(hào)。E至H為突變體tcl花藥細(xì)胞的 PCD信號(hào)檢測；第6發(fā)育階段的花藥細(xì)胞(圖2E)、第8發(fā)育階段的花藥(圖2F)、第9發(fā)育 階段的花藥(圖2G)和第10發(fā)育階段的花藥(圖2H)中無任何PCD信號(hào)被檢測。實(shí)施例3TCL基因的定位和克隆步驟一，定位群體，將tcl與秈稻品系龍?zhí)馗雜交，自交獲得F2代，選擇其中為 雄性不育植株為定位群體；步驟二，水稻DNA提取。采用改進(jìn)的CTAB法進(jìn)行提取，包括如下步驟取葉片 0.1 0.2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮，立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心 管，加入700ul 100°C預(yù)熱的1. 5xCTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入56°C水浴，20分鐘 后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，13000rpm離心10分鐘，取上清于新管 中，加入900ul無水乙醇混勻后_20°C放半小時(shí)以上。將析出的DNA離心，HOOOrpm離心10 分鐘。去掉上清，將沉淀用lml70%乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中， 4°C冰箱保存；步驟三，InDel分子標(biāo)記分析。共設(shè)計(jì)了 132對(duì)多態(tài)性標(biāo)記，SSR引物根據(jù)已發(fā)表 的序列合成(具體可參見http / / www. gramene. org. micro sat/s sr. htmlhttp : //www. gramene. org/microsat/ssr. html)，其他InDel分子標(biāo)記設(shè)計(jì)是根據(jù)比較粳稻日本晴和秈稻9311兩品系 的已公布的核酸序列，對(duì)差異的部分設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證2個(gè)親本粳稻9522和秈稻廣陸矮之間 的多態(tài)性，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?0ul 體系中，lul 模板，lul 10pmol/ul Primerl,lul lOpmol/ ul Primer2, lul 10XBuffer (Mg2+), lul 2mM dNTP,0. lul Taq，3. 9ul 水；之后通過 6% 的 PAGE膠電泳，銀染方法檢測。步驟四，群體分離分析初定位和精細(xì)定位應(yīng)用這些多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，在194個(gè)定位群體中發(fā)現(xiàn)突變基因與9 號(hào)染色體上的Marker Ch901和Lh901表現(xiàn)連鎖，進(jìn)一步擴(kuò)大定位群體(1162個(gè))和設(shè)計(jì)另 外的多態(tài)性標(biāo)記定位發(fā)現(xiàn)該基因處于距離為63. 6kb的Lh903-8和Lh903_5兩個(gè)Marker之 間(圖3A)。該區(qū)域包含7個(gè)編碼基因，其中一個(gè)編碼PHD finger蛋白的基因0s09g27620 為擬南芥雄性不育基因MSI的同源基因，通過對(duì)該基因的兩次測序，發(fā)現(xiàn)突變體tcl該基因 的第二個(gè)內(nèi)含子處有一個(gè)T堿基的插入。用分子標(biāo)記對(duì)定位群體中的雄性不育單株進(jìn)行基 因型分析，所用標(biāo)記的序列如表1所示。表1 InDel分子標(biāo)記及其核酸序列
Marker NameForward primer(5，-3')Reverse primer(5' -3')BAC NameCH901 LH903-5 LH903-8 LH903-9 LH903-2 LH902-3 LH901-1CAACCCATTCACTGACCGT TCCATGCCTGTGGGAACA GGCGAAAACTAACTTGTAGC CGATCCCTCCGTAACTAACT GTGTTGCCATTGCGATTGAG CGGAGATACTACACCGTGAC CCCAATACTCACCATAATCACCTGATCGCCGAAGCCTT GACGGCTATGTCATCAACTGC TCACTAGCTGCTGAAACGG TTCTTGCTTTGTTCCTCCTA GCCGAGCCTGTTGAAGATGA CACAAACTCCAAGACGCAAT AGCCTACTCACGGACTGTTTAP005420 AP005308 AP005308 AP005308 AP005308 AP005655 AP005676實(shí)施例4TCL基因的功能分析從水稻9522基因組中用引物TCL-lpF5 :5， -caccgtcgacGAGTTAACAAGTGGATGGTG-3，，禾口TCL-3R1 :5，-TTTggatcc ACAGTTGAAGGACGGGAACGACAC-3，；擴(kuò)增出含TCL全長基因組序列的5255bp片段，該片段覆蓋0s09g027620起始密碼 子上游3043bp和基因終止密碼子處(不包括終止密碼子)。將該片段通過Sail和BamHl 插入到Gateway載體PGWB7中，該構(gòu)建測序驗(yàn)證正確后通過熱擊導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，使用遺 傳手段轉(zhuǎn)化突變體幼穗愈傷，以觀察是否會(huì)引起植株恢復(fù)野生型性狀。L代獲得互補(bǔ)植株， 圖5顯示I；代互補(bǔ)植株tcl突變體花粉發(fā)育恢復(fù)，花藥中含成熟花粉變成黃色，T1代出現(xiàn) 可育不育植株的分離比為3 1(23株可育7株不育)。由此可見所克隆的0s09g027620 基因是引起tcl突變體雄性不育表型的基因；圖5中，E 表皮層，En 內(nèi)皮層，Mi 中層，T : 絨氈層，Tds 四分體，Ms 小孢子，DMs 降解的小孢子，ST 膨大的絨氈層。通過對(duì)花藥不育 突變體tcl花器官發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)TCL基因的突變會(huì)導(dǎo)致水稻在小孢 子早期絨氈層不能降解，小孢子不能發(fā)育成正常的成熟花粉粒，最后在突變體花藥中被徹底 瓦解(圖5)。說明TCL基因是調(diào)控水稻雄性不育的基因，對(duì)花藥絨氈層的降解具有調(diào)控作用。實(shí)施例5TCL啟動(dòng)子活性分析從水稻9522 基因組中用引物 TCL_lpF5 :5，-caccgtcgacGAGTTAACAAGTGGATGGTG-
93，和 TCL-pR :5，-aaaggatccCACCATCTTAGGCGCCAT-3，擴(kuò)增出含 TCL 啟動(dòng)子序列的3043bp 片 段。擴(kuò)增得到的TCL啟動(dòng)子通過SalI和BamHl插入到Gateway載體pGWB3中。構(gòu)建pGWB3 TCL pra:GUS通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化至野生型水稻愈傷組織中。通過分析B-半乳糖苷 酶的活性分析TCL啟動(dòng)子的表達(dá)模式，在轉(zhuǎn)基因的雜合子植株的根，莖，葉，小穗和小花中 通過⑶S染色液染色，染色后的組織用75 %的乙醇脫色處理，發(fā)現(xiàn)TCL主要在水稻花藥發(fā)育 的第8階段和第9階段的花藥中表達(dá)。將脫色處理的材料放入FAA固定液中固定，脫水，滲 透和樹脂包埋等處理，通過切片(IOym厚)和釕紅染色(0.05%，W/v，pH 9)20min，通過光 學(xué)顯微鏡下觀察(Leica DM2500)，我們發(fā)現(xiàn)TCL基因主要在絨氈層中表達(dá)，而且在小孢子 中也有表達(dá)。圖6A中，1-第6發(fā)育階段；2-第8發(fā)育階段；3-第9發(fā)育階段；4-第10階 段；5-第10階段晚期。圖6B中，St-雄蕊；圖6C中，T，絨氈層；Ms，小孢子。圖6中的箭頭 表示呈現(xiàn)GUS染色的花藥。序列表<110>上海交通大學(xué)<120>雄性不育基因TCL、編碼的蛋白及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞<130>10011<160>3<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2215<212>DNA<213>7jC稻(Oryza sativa)<400>1atggcgccta agatggtgat cagcctgggg agctcgcggc ggcggaagcg cggcgagatg 60ctgttccggt tcgaggcctt ctgccagccc ggctacccgg cgaacttcgc cggcgccggc 120ggcttcaggg acaacgtgag gacgctgctc ggcttcgcgc acctggaggc cggcgtccac 180ggcgagacca agtgctggtc gttccagctc gagctgcacc gccacccccc caccgtcgtg 240aggctcttcg tcgtcgagga ggaggtcgcc gcctcgccgc accgccagtg ccacctctgc 300cgccatattg gtccgtcgaa caaactacaa ttaatcaatc aacctttaca taggattgat 360ccgatcgatg ccatggtgtt gtagggtggg ggaggcatct gatatgcagc aagaggtatc 420acttcttgct gccgaggagg gaatcggcgg cggaagccga cggcctgtgc ttcgcgatca 480accacggcgg cggcggtggc gcggagaaag cgtcgtcgaa agggacgacg acgacggcct 540ccagcagagg ccacctgcta cacggcgtcg tgcacctcaa cggctacggc cacctcgtcg 600ccctccacgg cctcgagggc ggctccgact tcgtctccgg ccaccagatc atggacctct 660gggaccgcat ttgctcagcc ttgcacgtaa ggtagtagta gtatacatgt gcgtgtgcat 720gcatgcaagc aatgcaacga tgtcgggctg cgtgtgagaa catttgcttg ggcatggtgt 780ggtgtatgca aggacggtga gcctggtgga cacggcgagg aagggccaca tggagctgag 840gctgctgcac ggcgtcgcgt acggcgagac gtggttcggg cggtgggggt acaggtacgg 900ccggccgagc tacggcgtcg cgctgccgtc gtaccggcag tcgctgcacg tgctcggctc 960catgccgctc tgcgtgctgg tgccgcacct gtcgtgcttc agccaggagc tccccatggt 1020
ggtcaccaag taccaggcca tcagcggcca caagctgctc agcctcggcg acctcctccg 1080cttcatgctc gagctgcgcg cccgcctgcc ggccacctcc gtcacggcca tggactaccg 1140gggcatcatg tcggaggcct cgtgccggtg gtcggcgaag cgcgtcgaca tggcggcgcg 1200cgccgtcgtg gacgcgctcc gccgcgccga gccggcggcg cggtgggtca cgcggcagga 1260ggtgcgcgac gcggcgcgcg cctacatcgg cgacacgggc ctcctcgact tcgtgctcaa 1320gtccctcggc aaccacatcg tcggcaacta cgtcgtgcgc cgcaccatga acccggtgac 1380caaggtgctc gagtactgcc tcgaggacgt ctccagcgtg ctcccggcgg tcgccgccgg 1440
cggcggcgtg ccggcgcagg gcaagatgag ggtgaggttc cagctcacgc gtgcgcagct 1500catgagggac ctggtgcacc tgtaccggca cgtgctcaag gagcccagcc aggcgctcac 1560cggcggcgcg ttcggcgcga tcccggtggc ggtgcggatg gtcctggaca tcaagcactt 1620cgtcaaagat taccacgaag gacaagccgc ggcgagcagc aatggcggtg gcggattcgg 1680gcatccccac atcaacctgt gctgcacgct gctcgtgagc aacgggagcc cggagctagc 1740tccaccgtac gagacggtga ccctgccggc gcacgcgacg gtgggcgagc tgaagtggga 1800ggcgcagagg gtgttcagcg agatgtacct cggcctgagg agcttcgcgg cggactccgt 1860cgtcggggtc ggcgccgacc aggagggcct cccggtgctc gggctggtcg acgtcggaag 1920cgccgtcgtg gtgcaaggga gcgtgggcga gcagataaac ggggaggacc acgagaggaa 1980ggaggaggcg gcggcggcgg ccgtgtgcga ggggagcggc ggcggcgagc gcgtcgtgga 2040ctgcgcgtgc ggcgcggtgg acgacgacgg cgagcgcatg gcgtgctgcg acatctgcga 2100ggcgtggcag cacacgcggt gcgccgggat cgcggacacc gaggacgcgc cgcacgtctt 2160cctctgcagc cggtgcgaca acgacgtcgt gtcgttcccg tccttcaact gttag2215<210>2<211>679<212>PRT〈213> 水稻(Oryza sativa)<400>2Met Ala Pro Lys Met Val lie Ser Leu Gly Ser Ser Arg Arg Arg Lys151015Arg Gly Glu Met Leu Phe Arg Phe Glu Ala Phe Cys Gln Pro Gly Tyr202530Pro Ala Asn Phe Ala Gly Ala Gly Gly Phe Arg Asp Asn Val Arg Thr354045Leu Leu Gly Phe Ala His Leu Glu Ala Gly Val His Gly Glu Thr Lys505560Cys Trp Ser Phe Gln Leu Glu Leu His Arg His Pro Pro Thr Val Val65707580Arg Leu Phe Val Val Glu Glu Glu Val Ala Ala Ser Pro His Arg Gln859095Cys His Leu Cys Arg His lie Gly Trp Gly Arg His Leu lie Cys Ser1001051100161]LysArgTyrHisPheLeuLeuProArgArgGluSerAlaAlaGluAla0162]1151201250163]AspGlyLeuCysPheAlalieAsnHisGlyGlyGlyGlyGlyAlaGlu0164]1301351400165]LysAlaSerSerLysGlyThrThrThrThrAlaSerSerArgGlyHis0166]1451501551600167]LeuLeuHisGlyValValHisLeuAsnGlyTyrGlyHisLeuValAla0168]1651701750169]LeuHisGlyLeuGluGlyGlySerAspPheValSerGlyHisGinlie0170]1801851900171]MetAspLeuTrpAspArglieCysSerAlaLeuHisValArgThrVal0172]1952002050173]SerLeuValAspThrAlaArgLysGlyHisMetGluLeuArgLeuLeu0174]2102152200175]HisGlyValAlaTyrGlyGluThrTrpPheGlyArgTrpGlyTyrArg0176]2252302352400177]TyrGlyArgProSerTyrGlyValAlaLeuProSerTyrArgGinSer0178]2452502550179]LeuHisValLeuGlySerMetProLeuCysValLeuValProHisLeu0180]2602652700181]SerCysPheSerGinGluLeuProMetValValThrLysTyrGinAla0182]2752802850183]lieSerGlyHisLysLeuLeuSerLeuGlyAspLeuLeuArgPheMet0184]2902953000185]LeuGluLeuArgAlaArgLeuProAlaThrSerValThrAlaMetAsp0186]3053103153200187]TyrArgGlylieMetSerGluAlaSerCysArgTrpSerAlaLysArg0188]3253303350189]ValAspMetAlaAlaArgAlaValValAspAlaLeuArgArgAlaGlu0190]3403453500191]ProAlaAlaArgTrpValThrArgGinGluValArgAspAlaAlaArg0192]3553603650193]AlaTyrlieGlyAspThrGlyLeuLeuAspPheValLeuLysSerLeu0194]3703753800195]GlyAsnHislieValGlyAsnTyrValValArgArgThrMetAsnPro0196]3853903954000197]ValThrLysValLeuGluTyrCysLeuGluAspValSerSerValLeu0198]4054104150199]ProAlaValAlaAlaGlyGlyGlyValProAlaGinGlyLysMetArg
420425430Val Arg Phe Gln Leu Thr Arg Ala Gln Leu Met Arg Asp Leu Val His435440445Leu Tyr Arg His Val Leu Lys Glu Pro Ser Gln Ala Leu Thr Gly Gly450455460Ala Phe Gly Ala lie Pro Val Ala Val Arg Met Val Leu Asp lie Lys465470475480His Phe Val Lys Asp Tyr His Glu Gly Gln Ala Ala Ala Ser Ser Asn485490495Gly Gly Gly Gly Phe Gly His Pro His lie Asn Leu Cys Cys Thr Leu500505510Leu Val Ser Asn Gly Ser Pro Glu Leu Ala Pro Pro Tyr Glu Thr Val515520525Thr Leu Pro Ala His Ala Thr Val Gly Glu Leu Lys Trp Glu Ala Gln530535540Arg Val Phe Ser Glu Met Tyr Leu Gly Leu Arg Ser Phe Ala Ala Asp545550555560Ser Val Val Gly Val Gly Ala Asp Gln Glu Gly Leu Pro Val Leu Gly565570575Leu Val Asp Val Gly Ser Ala Val Val Val Gln Gly Ser Val Gly Glu580585590Gln lie Asn Gly Glu Asp His Glu Arg Lys Glu Glu Ala Ala Ala Ala595600605Ala Val Cys Glu Gly Ser Gly Gly Gly Glu Arg Val Val Asp Cys Ala610615620Cys Gly Ala Val Asp Asp Asp Gly Glu Arg Met Ala Cys Cys Asp lie625630635640Cys Glu Ala Trp Gln His Thr Arg Cys Ala Gly lie Ala Asp Thr Glu645650655Asp Ala Pro His Val Phe Leu Cys Ser Arg Cys Asp Asn Asp Val Val660665670Ser Phe Pro Ser Phe Asn Cys675<210>3<211>3043<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<400>3gagttaacaa gtggatggtg cttactgatt ctgcttggaa gattggagca aaaggactag 60
aaagtgcattcttgaaggtt ctttgtgatc ctctttatta ttattttcct ttgtatccct120ccagtttttctttttctttt gactaattca gttttttttc cttgaagggt ggtagtgcat180tgactctgaa aatgatctat gaatcggtag gtatactgtt ttatgaagtt agattgattt240
tactttttcttacagcatca ttagacatta atggacttat catcatggta gttagccaag300agactatctg gaaagctgct catggaggct ggtaaatatg agataaagaa agaacttcta360aagcaggtatatgtatttta gttgatatct gtaagcaatt tttcctgatt ttattatttg420ctcatctcataattctttta acagaataat agatatactc atgttctggc cccacctgaa480aaatgcagta gcatagcttg atacacagat catatacaca agctgtaact atttttttaa540ttgttataataaatatcctt tgggagtact gaggtttgcc atctgcaggg tggacgatta600gctgctgtta atctggagtc tcgagctggt ttgcttgcag ctaggcaggt aacattctca660tctgtcagca gctacttcca tgcataattg gtatattatg ctcccagtat tatctgaaaa720actgcacattttagatggtc gtttgaataa tcctcttgaa tgtatgcatg cagggtttgg780cacgtgcagcatctagatat gttggtctta ggagtgtcat gacgtttctt ggaccaatgt840atgtttctgctaatatatct ggaatctgtt tgttgctgta tttttttaaa tcaataatac900actatcaggtttccgcatgt ttctataaaa aatttgacct cttttccttt ttggtcaata960gtaggttcttatggttaatt tatttttggg tgcatgatgt attcatgttt tgctacttca1020acttgctgttctgagtttac tgtttgtcag atctactttt taagtaatga ttcattcaca1080ataagcttcttcaaatgctt tgttgtgttg aattttgagc agactataaa tcagttactg1140actcttctgttctacaactt cttgctgcat agaatgtggg ggacactctt ggctgacatt1200gtgatccaaatgcttgggac agactatgct agaattgtgc aggcaatcta tgcttttgct1260caggtgagcttctgattgtt cagtttttcg tccagtaact cactgtccat ccattgagtt1320cacatcttagcctttctaac agattcggct gactaggaca tcttacatag aatctcatga1380agaataatcaacagtgggac atttctggtc tggactaaca gggcattctg ggcccatagt1440gtacattctgatcatgcaga acatttttgg ttgagtgctg gcgcaattct cccaagagga1500ctcgaggacagtaagttcat actttcacag aagttgtgca gctgatgtaa atgcatagaa1560gttagatgacagaacaattg atagatgcta ggtaggatag atggtacaga tgacacacaa1620atcatctatgcttttgaatt ctccaaggtt taaggctgct gcttaagtga gagcttgtta1680tacattccaggaaaaattaa tttactgcca ctatagaatg gtgtaattgt atttaagaaa1740tagctcacaatgaccattag ggccacctac tctctaaacg cggtagttgt gaatgaatat1800acatccacttcacacttcca cgagggcccg aagttgtaga ccatgcattc cattctgctc1860cagttaattatgcaacaaaa cggttcccct gatcttaaac tattgccccc ctaacattca1920gttaggcaaggcatacttca ttgacattag tccatgctta tcccagccat atgttacaga1980tatgcttacgtgtaaacacc agggcataat ttgcatgttg caccctgctt attcccctta2040tcaaaacactagcaactaat ttatcagtac aggctagata tcattattca aaatcgcaac2100aagtatggtatactcacatt accaaaactt gccatacttc atttagctaa catgtctaac2160atgtggccaacaaaattaaa gccacacttt agccatagga gagtaaactt gccacacttt2220tatgtgccaatgacatgtag gacccacatc atggtgaagg aatcttgtta aaagtgtggc2280cgaatgccta actaagtcaa acctggctaa cttgagttgt ggcatgatga2340ggcaaattgtggtagtgaac cttaatatct acttcctccg tttcaggtta2400
taagacttcattgcctacat tcatatagat gttaacgaat ctagacacat ttatataaat2460gtgtctagattcgttaacat ctatatgaat gtatataaat gtgtctagat tcgttaaaca2520tctatatgaa tgtgggcaat actagaaatt cttataacct gaaatggatg tagtactaga2580ttgtgtaacaattcagatag ctagtgcaat tggtgattga ttaattttac agtccttatg2640tatttggaggtatcataatc ttaagtgtta atttgtgata cctcctggtc ctcaacacta2700gagagatactaagtggtaac actgcaaaat gtggcatctc ctggtacctt ttaagtacca2760aatgcactaggtgcctttgc gcaaaattcc cagatgagag gacccaattt gtgatcgtgt2820gcgacatgtctagaagggtg gcccattgtt tacattcctt caccagatcg ccgaagcttt2880ctaaatcgcgggcacttaac gcgtgagaag cccaatgaga cctccaaatg ctaaccttaa2940aatcgcagcgctgcacggcg acatggtctc ctagctagct gcctagcttc tcggcgacgt3000tgattggcagcaactagcta gctcgccgtc cggccggccg gcc304權(quán)利要求
一種雄性不育基因TCL，其特征在于，該基因編碼如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)(a)由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雄性不育基因TCL，其特征是，所述基因的堿基序列如SEQID NO 1所示。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雄性不育基因TCL表達(dá)的啟動(dòng)子，其特征在于，其堿基序 列如SEQ ID NO 3所示。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雄性不育基因TCL編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì) 的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
5.一種質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒包含堿基序列如SEQ ID NO :1所示的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒，其特征是，所述質(zhì)粒還包含堿基序列如SEQID N0:3所 示的啟動(dòng)子。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，該宿主細(xì)胞包含堿基序列如SEQ IDNO :1所示的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征是，所述宿主細(xì)胞還包含堿基序列如SEQ ID NO :3所示的啟動(dòng)子。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的雄性不育基因TCL、編碼的蛋白及啟動(dòng)子、質(zhì)粒和宿主細(xì)胞；本發(fā)明涉及的雄性不育基因TCL為編碼如下(a)或(b)所述的蛋白質(zhì)的基因(a)由SEQID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有影響絨氈層細(xì)胞程序性死亡活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；本發(fā)明還涉及一種堿基序列如SEQ ID NO3所示的啟動(dòng)子；本發(fā)明還涉及一種氨基酸序列如SEQ IDNO2所示的蛋白質(zhì)；本發(fā)明還涉及一種包含堿基序列如SEQ ID NO1所示的基因的質(zhì)粒以及宿主細(xì)胞。本發(fā)明的TCL基因具有維持水稻花藥絨氈層細(xì)胞程序性死亡的功能，該基因功能的缺失導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞發(fā)生壞死，導(dǎo)致水稻的雄性不育。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101805741SQ201010301369
公開日2010年8月18日 申請(qǐng)日期2010年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者張大兵, 李暉, 梁婉琪, 袁政 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)