一個豬6號染色體上用于溯源的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬食品安全領(lǐng)域，具體涉及一個豬6號染色體上用于溯源的SNP分子標(biāo)記 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會的發(fā)展，食品供應(yīng)鏈中的環(huán)節(jié)在不斷增加，從農(nóng)場、牧場到食品企業(yè)的加 工、包裝、儲藏、運(yùn)輸和銷售，食品供應(yīng)的各個環(huán)節(jié)存在食品的安全隱患，食品安全問題常有 發(fā)生。因此需要進(jìn)行肉制品的可追溯管理，建立從產(chǎn)地到餐桌的各個環(huán)節(jié)的追溯體系，從而 為消費(fèi)者提供準(zhǔn)確而詳細(xì)的有關(guān)產(chǎn)品的信息，有利于生產(chǎn)經(jīng)營者及時發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的 不安全隱患。從20世紀(jì)90年代中期的食品安全危機(jī)開始，肉產(chǎn)品的追溯已經(jīng)作為一種安 全控制措施，受到世界多個國家的高度重視。肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)加強(qiáng)了政府部門對肉產(chǎn)品質(zhì) 量安全的監(jiān)管能力，因此許多國家紛紛建立肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)用以降低肉產(chǎn)品質(zhì)量安全中存 在的風(fēng)險。
[0003] 肉產(chǎn)品溯源技術(shù)有標(biāo)簽溯源技術(shù)、同位素溯源技術(shù)、礦物元素指紋溯源技術(shù)、有機(jī) 物溯源技術(shù)虹膜特征技術(shù)和DNA標(biāo)記溯源技術(shù)（或DNA溯源技術(shù)）等，其中DNA溯源技術(shù)因 為檢測手段簡單、快速、難以偽造等特點(diǎn)成為世界各國廣泛應(yīng)用的快速溯源技術(shù)。與其他標(biāo) 記方法相比，DNA標(biāo)記具有特有放入優(yōu)越性：它直接以DNA形式出現(xiàn)，在生物體的各個組織、 各發(fā)育時期均可檢測到，不受環(huán)境因素的影響，并且標(biāo)記數(shù)量多，遍及生物體整個基因組。
[0004] SNP標(biāo)記是指基因組同一位點(diǎn)上單個核苷酸的變異，一般表現(xiàn)為二等位基因，適宜 高通量自動化分析，所以成為動物身份識別最受關(guān)注的分子標(biāo)記。
[0005] 但是用于肉產(chǎn)品溯源的SNP標(biāo)記不同于一般的SNP標(biāo)記，對于單個的SNP標(biāo)記，它 必須至少具有以下特征：（1)變異度高，在品種或品系中等位基因頻率接近；(2)品種間等 位基因分布頻率差異小；（3)雜合度大于等于0. 3。
[0006] 在長期的育種工作中，研究者積累了大量的SNP標(biāo)記，由于單個SNP溯源標(biāo)記是無 法完成溯源的，因此，需要一組相互獨(dú)立的SNP標(biāo)記才能實(shí)現(xiàn)溯源。以現(xiàn)有的13個已知SNP 分子標(biāo)記作為溯源標(biāo)記組合，在經(jīng)過高度選擇引進(jìn)的豬群體中，使用該組標(biāo)記進(jìn)行溯源時， 會出現(xiàn)某些個體不能區(qū)分的情況。
[0007] 另外，在長期的育種工作中，積累的大量的SNP標(biāo)記往往集中分布在某些染色體 上，而另外部分染色體，如5號，6號，8號，14號，15號和18號染色體等則缺乏SNP標(biāo)記，容 易導(dǎo)致分子標(biāo)記間出現(xiàn)連鎖現(xiàn)象，分子標(biāo)記之間不能互相獨(dú)立，縮小溯源實(shí)驗(yàn)的檢測范圍， 導(dǎo)致實(shí)際可檢測范圍小于預(yù)期可檢測范圍。因此，為了滿足對豬肉產(chǎn)品進(jìn)行DNA溯源的要 求，需要開發(fā)其他染色體上用于溯源的SNP標(biāo)記，提高溯源檢測范圍及準(zhǔn)確度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一個豬6號染色體上用于溯源的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用， 可以廣泛用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源及其檢測，特別是用于豬肉產(chǎn)品的安全性溯源，完善了現(xiàn) 有標(biāo)記組合，提高溯源檢測準(zhǔn)確度，擴(kuò)大了溯源規(guī)模。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 豬6號染色體上用于溯源的SNP分子標(biāo)記，該SNP分子標(biāo)記的DNA序列如SEQID NO. 1所示，共578bp，第232位堿基處有一個堿基替換，為232C或232T。
[0011] 進(jìn)一步，所述的SNP分子標(biāo)記由Ec〇130I限制性內(nèi)切酶識別。
[0012] 所述的SNP分子標(biāo)記是通過NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對獲得的，并在包括10個豬品種 或品系的試驗(yàn)群體（共計245個個體）中，分析該SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的 分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種 或品系間等位基因頻率分布差異小，初步判定該SNP標(biāo)記可用作豬肉產(chǎn)品DNA溯源。
[0013] 所述的用于豬肉DNA溯源的SNP分子標(biāo)記的獲得方法，采用PCR-Ecol30I-RFLP方 法進(jìn)行，包括以下步驟：
[0014] (1)在NCBI上搜索豬6號染色體的DNA序列信息，設(shè)計正、反向引物
[0015] 分離豬6號染色體的DNA片段；
[0016] (2)利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行序列比對，尋找存在堿基替代的位點(diǎn)；
[0017] (3)PCR-Ec〇130I-RFLP檢測方法的建立及替換位點(diǎn)的檢測；
[0018] (4)采集10個品種和品系的耳組織樣，共計245個個體；
[0019] (5)檢測SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布，統(tǒng)計分析，并進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證是否適用 于豬肉產(chǎn)品溯源中。
[0020] 其中，上述獲得SNP分子標(biāo)記的方法中，所述的分離豬6號染色體上DNA片段的 正、反向引物序列如下：
[0021] 正向引物：5' -CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3'（如SEQIDN0. 2 所示）；
[0022] 反向引物：5' -TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3'（如SEQIDNO. 3 所示）。
[0023] 在DNA溯源過程中，每增加一個溯源位點(diǎn)，就能進(jìn)一步擴(kuò)大檢測樣本的數(shù)目，準(zhǔn)確 性也就更高，理想的SNP位點(diǎn)應(yīng)該是均勻分布在豬不同的染色體上，而現(xiàn)有的SNP位點(diǎn)中缺 乏6號染色體上的溯源標(biāo)記。
[0024] 本發(fā)明通過NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對檢測到豬6號染色體上的存在的SNP分子標(biāo)記， 在包括10個豬品種或品系的試驗(yàn)群體中，分析該SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的分 布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記在不同的品種或品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富，品種或 品系間等位基因頻率分布差異小，并且雜合度都大于0. 3,初步判定該SNP標(biāo)記可用作豬肉 產(chǎn)品DNA溯源以及豬肉產(chǎn)品的安全性溯源中。
[0025] 為了完善已有SNP分子標(biāo)記組合，提高溯源實(shí)驗(yàn)的檢測準(zhǔn)確度，擴(kuò)大溯源規(guī)模，將 本發(fā)明獲得的豬6號染色體上的新SNP分子標(biāo)記位點(diǎn)與其它現(xiàn)有已公開的SNP分子標(biāo)記位 點(diǎn)結(jié)合在一起（共計14個SNP位點(diǎn)）進(jìn)行溯源實(shí)驗(yàn)。
[0026] 本發(fā)明在溯源實(shí)驗(yàn)中，增加商品豬來源，在屠宰場共挑選了來自不同豬場的300 個個體，從300個個體中隨機(jī)挑選100個個體，檢測該100個個體中14個SNP位點(diǎn)的基因 型，統(tǒng)計每個個體的基因型結(jié)果，發(fā)現(xiàn)100個個體均擁有各自不同的基因型，能實(shí)現(xiàn)個體區(qū) 分；同時，隨機(jī)在這100個個體中挑取20份肌肉樣，同樣檢測統(tǒng)計14個SNP分子標(biāo)記位點(diǎn) 的基因型，然后跟100個個體的基因型進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)均能找到與20份肌肉樣品基因 型完全一致的個體，即通過溯源在100個個體中找到20份豬肌肉的來源個體，因此判定本 發(fā)明的該SNP分子標(biāo)記可以用于豬肉產(chǎn)品溯源。
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0028] 本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記位于豬的6號染色體上，能進(jìn)一步完善標(biāo)記的檢測覆蓋面， 提高溯源的準(zhǔn)確性，并擴(kuò)大豬的DNA溯源SNP分子標(biāo)記的檢測范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0030] 實(shí)施例1分子標(biāo)記的查找
[0031] (1)引物設(shè)計
[0032] 以豬6號染色體的DNA序列（Genbank:FN673773)為模板，設(shè)計引物分離豬的DNA 片段（以一頭申農(nóng)豬的DNA為PCR擴(kuò)增的模板），引物如下：
[0033] 正向引物：5' -CTTTACCGTTCTGCCCTTTC-3'（如SEQIDN0. 2 所示）；
[0034]反向引物：5' -TCCTCTGCCTGCCTTTGA-3'（如SEQIDNO. 3 所示）。
[0035]PCR反應(yīng)總體積為20μ1，其中豬基因組DNA約100ng，含lXbuffer(Promega公 司），1. 5mmol/LMgCl2,dNTP(上海生工生物公司）終濃度為150ymol/L，引物終濃度為 0· 2μmol/L，2UTaqDNA聚合酶（Promega公司）。
[0036] PCR擴(kuò)增：94°C4min，（94°C30s，60°C退火 30s，72°C30s)循環(huán) 30 次，最后 72°C延 伸 10min〇
[0037] PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢 測。
[0038](2)克隆測序分析
[0039] 將得到的豬6號染色體的DNA片段按照如下方法進(jìn)行克隆。
[0040] PCR產(chǎn)物的純化：在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上