一種豬鏈球菌2型五基因缺失株及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于家畜傳染病基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬鏈球菌2型五基 因缺失株及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬鏈球菌屬革蘭氏陽性菌，兼性厭氧，呈鏈狀或成對存在，是一種重要的病原微生 物，按照莢膜抗原的不同，共分為35個血清型（1-34和1/2)，其中，豬鏈球菌2型被認(rèn)為是 毒力最強、臨床分離率最高的一種血清型（Wertheim HF et al.，Streptococcus suis:an emerging human pathogen. Clin Infect Dis 2009;48:617-25·)。能導(dǎo)致急性敗血癥及 一系列炎癥，比如腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、心內(nèi)膜炎等。自從1954年首次被報道，目前為 止，豬鏈球菌致病的案例在30多個國家和地區(qū)均有發(fā)生，中國曾經(jīng)有過多次豬鏈球菌病大 爆發(fā)，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成極大損失。豬鏈球菌在豬的呼吸道和扁桃體中具有很高的分離率， 致病的季節(jié)性不強，全年都有可能發(fā)生，且病死率極高，即使是妊娠母豬也可帶菌，多見于 陰道和子宮，這將導(dǎo)致豬幼崽面臨極大的感染風(fēng)險。此外，自從1968年首次有報道人感染 豬鏈球菌導(dǎo)致腦膜炎，目前有不少于1600個人感染病例（Feng Y et al.，Streptococcus suis infection An emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases ? Virulence, 2014, 5(4) :477-497.)，主要癥狀有化膿性腦膜炎、耳聾、運動功能 紊亂等，更有甚者出現(xiàn)中毒休克樣綜合征，導(dǎo)致多臟器衰竭及死亡。人感染豬鏈球菌主要存 在于北歐及東南亞的國家，中國國土龐大人口眾多，且喜食豬肉，對豬的需求量巨大，因此， 豬鏈球菌帶來的危害也更大。
[0003] 與抗菌藥物相比，通過接種疫苗防治豬鏈球菌病是當(dāng)前公認(rèn)的有效的、可持續(xù)發(fā) 展的方法。目前在臨床上應(yīng)用較多的是全菌滅活疫苗，但它存在一些瓶頸問題。第一，滅活 疫苗缺乏部分有效組分，免疫效果受限。已有文獻報道病原菌的部分重要毒力因子在體外 培養(yǎng)時并不表達，只有在進入宿主體內(nèi)才受到誘導(dǎo)表達，而這部分蛋白可能在感染過程中 發(fā)揮重要作用并且是重要的免疫原性蛋白。第二，滅活疫苗一般需要通過多次免疫才能獲 得較好的免疫效果。第三，滅活疫苗中某些組分以及佐劑成分共同作用會導(dǎo)致動物產(chǎn)生全 身的或局部的不良反應(yīng)。隨著豬鏈球菌病流行的日益嚴(yán)重，針對豬鏈球菌尤其是影響與危 害最大的豬鏈球菌2型，制備一種新型、安全、有效的基因工程減毒活疫苗尤為重要。
[0004] 莢膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS)是豬鏈球菌公認(rèn)的毒力因子，在抵 抗免疫細(xì)胞的吞噬殺傷中發(fā)揮重要作用。學(xué)者們期望通過以豬鏈球菌莢膜缺失菌株研發(fā) 減毒活疫苗，然而Wisselink HJ等發(fā)現(xiàn)無莢膜的豬鏈球菌制備活疫苗誘導(dǎo)的抗體水平較 低，并且最后證明無莢膜菌株不能給豬提供保護力（Wisselink HJ et al.，Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serot ype 2. Vet Microbiol. 2002 ;84 (1-2):155-68.)〇 此外，由于莢膜良好的免疫原性和反應(yīng)原性，已有多位學(xué)者建立了以豬鏈球菌莢膜多糖為 包被抗原的酶聯(lián)免疫吸附方法（CPS-ELISA) (del Campo Sepiilveda EM et al.，Detection of antibodies against Streptococcus suis capsular type 2using a purified capsular polysaccharide antigen-based indirect ELISA. Vet Microb iol. 1996 ； 52(1-2) : 113-25.)，并且有公司生產(chǎn)了相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。以上研究表明在豬鏈 球菌疫苗和檢測試劑盒的研發(fā)中應(yīng)該充分考慮豬鏈球菌莢膜多糖的重要性，破壞豬鏈球菌 的莢膜多糖將影響到疫苗的效果和在檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0005] 然而，早期發(fā)現(xiàn)與豬鏈球菌致病性密切相關(guān)的部分毒力因子，卻顯著影響莢膜 多糖的形成。例如：Li Μ和付忠琳等人發(fā)現(xiàn)SalK/R雙組份系統(tǒng)的基因缺失株抵抗中性 粒細(xì)胞殺傷的能力和毒力顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)該菌株不能形成莢膜，證明雙組分調(diào)控系 統(tǒng)SalK/R通過調(diào)控莢膜的形成來抵抗免疫細(xì)胞的吞噬殺傷（Li M et al.，SalK/SalR，a Two-Component Si gnal Transduction System, Is Essential for Full Virulence of Highly Invasive Streptococcus suis Serotype 2.PloS ONE,2008 ；3 (5):e2080.) (付忠琳等，2型豬鏈球菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)SalK/SalR抗吞噬機制的初步研究，細(xì)胞與 分子免疫學(xué)雜志，2013第（29)卷第（6)期570-573頁）。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)新型毒力因子 HP0197通過減少莢膜多糖的形成，降低豬鏈球菌的抗吞噬殺傷能力和致病力（Zhang A et al. , HP0197contributes to CPS synthesis and the virulence of Streptococcus suis via CcpA.PLoS 0ne，2012,7(ll):e50987)。綜上所述，盡管以上毒力因子對應(yīng)的基因缺失 株毒力顯著降低，卻導(dǎo)致豬鏈球菌的重要抗原一一莢膜多糖消失或含量降低，一定程度上 限制了這些基因缺失株在基因工程減毒疫苗上的進一步應(yīng)用。此外，也限制了該類基因工 程缺失株在檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0006] 因此，獲得一種能莢膜多糖正常表達的減毒菌株在豬鏈球菌基因工程減毒活疫苗 的研發(fā)中顯得尤其重要。為實現(xiàn)以上目標(biāo)，可通過設(shè)計并構(gòu)建一種降低豬鏈球菌免疫逃逸 能力并且不影響豬鏈球菌莢膜多糖合成的減毒菌株實現(xiàn)，這也是本申請的重要創(chuàng)新點之 〇
[0007] 在宿主抵抗病原菌的感染中，中性粒細(xì)胞（Polymorphonuclear neutrophil)是 免疫系統(tǒng)抵抗感染的第一道防線。當(dāng)病原入侵造成感染時，中性粒細(xì)胞可以迅速向感染部 位募集，對入侵的病原菌發(fā)揮吞殺傷和清除作用（Chabot-Roy G et al.，Phagocytosis and killing of St reptococcus suis by porcine neutrophils. Microb Pathog, 2006 ； 41 (1) :21-32.)。但是，豬鏈球菌具有免疫逃逸機制，能夠逃避中性粒細(xì)胞的吞噬殺傷和清 除作用。因此，如果能通過基因工程的方法缺失豬鏈球菌免疫逃逸相關(guān)基因，減弱甚至消除 豬鏈球菌的免疫逃逸功能，不僅有助于宿主免疫系統(tǒng)在第一時間吞噬和清除豬鏈球菌，而 且有助于免疫細(xì)胞快速遞呈相關(guān)抗原，激活宿主的獲得性免疫系統(tǒng)，使宿主得到免疫保護 作用。經(jīng)過研究和篩選，本研究通過缺失Sly、ScpA、SsnA、Fhb和SsadS 5個不影響豬鏈球 菌莢膜多糖形成的基因來減弱豬鏈球菌的免疫逃逸作用。5個基因的基本功能如下：
[0008] 豬鏈球菌溶血素（Sly)是很多毒力菌株生長過程中釋放的一種分泌型蛋白，溶 血素基因以單拷貝形式存在。溶血素是膽固醇結(jié)合類細(xì)胞毒素，其活性能被還原劑活 化，被氧化劑和膽固醇抑制，被氧化劑抑制的活性遇到還原劑時可重新恢復(fù)。溶血素對 紅細(xì)胞的裂解能力具有物種特異性，人的〇型紅細(xì)胞對其最易感，其次是馬、綿羊、牛、和 豬的紅細(xì)胞。溶血素對不同的宿主細(xì)胞都具有細(xì)胞毒性，如不同的上皮細(xì)胞系、微血管 內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。溶血素在豬鏈球菌裂解和侵入寄主細(xì)胞的過程中起到了重要的 作用(He Z et al. , Increased production of suilysin contributes to invasive infection of the Streptococcus suis strain 05Z YH33. Molecular Medicine Reports, 2014, (10):2819-2826)〇
[0009] 豬鏈球菌中的C5a肽酶類似物（ScpA)被認(rèn)為與腦膜炎有關(guān)，用重組的ScpA蛋白 刺激巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明可以刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1 β，IL-6, TNF-α，CXCL8and CCL5。而該蛋白滅活后仍然具有此功能，表明ScpA刺激巨噬細(xì)胞是通過非蛋白酶水解途 徑。特定激酶抑制劑實驗表明，ScpA可能是通過促分裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)到途徑起 作用。有證據(jù)表明ScpA能夠降解細(xì)胞因子CCL5。此外，ScpA能降解明膠，還可通過水解 纖維蛋白原的的Αα鏈來阻止凝血酶的纖維蛋白的形成，還表現(xiàn)出對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞毒 性。缺少該基因后，豬鏈球菌在全血殺菌實驗中表現(xiàn)出較高的敏感性，小鼠攻毒實驗表明該 基因缺失對毒力有較大影響。（Kaqawa TF et al·，Model for substrate interactions in C5a pepti dase from Streptococcus pyogenes:A 1. 9 A crystal structure of the active form of ScpA. . Journal of Molecular Biology, 2008, 386 (3):754-772.)
[0010] 分泌型核酸酶（SsnA)不僅在豬鏈球菌2型中有表達，而且在致病性豬鏈球菌血清 型1-9都有表達。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該核酸酶含有3個較為保守的序列，分別是一段編 碼35個氨基酸的信號肽序列、一段編碼22個氨基酸的DNA結(jié)合區(qū)域以及一段革蘭氏陽性 菌細(xì)胞壁的特有基序。研究表明，SsnA在整個豬鏈球菌的生長過程中都表達。用SsnA制 備的抗血清能中和SsnA的活性。利用核酸電泳和Western印跡分析菌株SX332和它的缺 失株的亞細(xì)胞成分，表明Ssn