一種利用細菌發(fā)酵制備三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細菌纖維素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備細菌纖維素的方法，特別涉及一種利用細菌發(fā)酵制備三 維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細菌纖維素的方法，屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素是地球上含量最豐富的天然高分子化合物，自然界天然纖維素絕大部分由 植物產(chǎn)生。除植物纖維素外，某些微生物也可合成纖維素，此類纖維素通稱細菌纖維素，其 化學結(jié)構(gòu)與植物纖維素相似，均是由D-吡喃葡萄糖單體以β -1，4糖苷鍵連接而成的線性 多糖。細菌纖維素是由生長在液態(tài)含糖基質(zhì)中的細菌產(chǎn)生并分泌到基質(zhì)中的纖維素成分， 在培養(yǎng)液表面形成一層透明的凝膠狀薄膜。其不是細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)成分，而是一種胞外 產(chǎn)物。細菌纖維素作為一種新型生物材料，具有許多獨特的性質(zhì)：如純度高，不含木素和其 他細胞壁成分；吸水性強、結(jié)晶度高、聚合度高；有較高的生物適應(yīng)性和良好的生物可降解 性；生物合成性能可調(diào)控等。細菌纖維素是目前最具發(fā)展前景的生物基礎(chǔ)材料和納米生物 材料之一，在食品、造紙、功能材料和生物醫(yī)學等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 然而當前，阻礙人們廣泛、高效利用細菌纖維素的瓶頸，一是細菌纖維素的改性手 段有限，二是發(fā)酵制備細菌纖維素工藝仍需進一步優(yōu)化。細菌纖維素與水分子及其自身之 間可形成大量氫鍵，構(gòu)成巨大的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而導致致密晶體結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，嚴重阻礙了化學 試劑與細菌纖維素的有效接觸與反應(yīng)，極大限制了細菌纖維素的表面化學改性及應(yīng)用。隨 著人們對細菌纖維素材料的深入研究，發(fā)現(xiàn)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)疏松、孔徑均一、結(jié)晶度低且易溶 解的細菌纖維素，作為一種基礎(chǔ)生物材料，具有更為廣泛的應(yīng)用價值和前景。
[0004] 在細菌纖維素發(fā)酵制備領(lǐng)域，中國專利（ZL 201210333137. X) "一種控制細菌 纖維素聚合度的細菌纖維素微生物制備方法"以細菌纖維素產(chǎn)生菌一葡糖酸醋酸桿菌 (⑶-BC-1CCTCC Μ 208149)作為發(fā)酵菌株，通過調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)方式、發(fā)酵時 間等達到控制細菌纖維素聚合度的目的，使其平均聚合度在1361~2350范圍內(nèi)，且控 制方法簡單，可適應(yīng)各種工業(yè)加工的需求，提高了細菌纖維素的產(chǎn)品品質(zhì)；中國專利（ZL 201310740132. 3) "一種在發(fā)酵過程中降低細菌纖維素結(jié)晶度的方法"在細菌的發(fā)酵過程 中加入熒光增白劑，降低了細菌纖維素纖維帶的聚集狀況，從而降低了其結(jié)晶度，方法簡單 快速，不會對細菌纖維素的分子量造成影響，成本較低，對細菌纖維素的結(jié)晶度具有很好的 調(diào)控作用；中國專利（ZL 201110063655. X) "一種在發(fā)酵過程中改性細菌纖維素的方法" 將羥丙甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵過程中改變其網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)，降低其分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用，制備得到的細菌纖維素產(chǎn)品具有很好的復水性，擴 大了其應(yīng)用范圍；美國專利（US 20110286948Α1) "Bacterial cellulose film and uses thereof"以木醋桿菌（23769)為生產(chǎn)細菌纖維素菌種，在添加了不同分子量PEO的HS培養(yǎng) 基中攪拌培養(yǎng)，得到棉花狀的納米復合纖維素，冷凍干燥后形成多孔性物質(zhì)，并且容易模塑 成所需形狀，相比于干燥后的純纖維素，該納米復合材料彈性性能得以大幅提高；美國專利 (US6060289A) "Modified bacterial cellulose" 以巴氏醋酸桿菌（FERM BP-4176)為產(chǎn)細 菌纖維素菌種，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入細胞分裂抑制劑萘啶酸、氯霉素和有機還原劑二硫蘇 糖醇，發(fā)酵制備改性細菌纖維素，改變了帶狀纖維的寬度和厚度，提高了楊氏模量。截至目 前，還未見到以醋酸桿菌（AJ 12368)、木醋桿菌（ATCC 23769)和木醋桿菌（CGMCC 1. 1812) 為產(chǎn)細菌纖維素菌種，借助水溶性高分子化合物結(jié)構(gòu)調(diào)控作用，發(fā)酵制備三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細 菌纖維素的相關(guān)工藝技術(shù)出現(xiàn)。
[0005] 隨著人們對天然環(huán)境友好材料需求的不斷提升，進一步明確細菌纖維素的生物合 成及其結(jié)構(gòu)性能調(diào)控機理，通過結(jié)構(gòu)調(diào)控制備具有獨特形貌性能的細菌纖維素具有重要意 義。細菌纖維素是一種極具應(yīng)用潛力的生物材料，改變其原有生物結(jié)構(gòu)，在發(fā)酵過程中進行 結(jié)構(gòu)干預，賦予其新的性能，可極大拓寬細菌纖維素產(chǎn)品的應(yīng)用價值和領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服目前發(fā)酵制備的細菌纖維素結(jié)構(gòu)致密、結(jié)晶度高、難溶解和加工等問題， 本發(fā)明借助水溶性高分子化合物的結(jié)構(gòu)調(diào)控作用，以細菌發(fā)酵制備具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細 菌纖維素產(chǎn)品，提高其化學反應(yīng)位點和活性，進而拓寬其應(yīng)用價值和領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是 提供一種利用細菌發(fā)酵制備三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細菌纖維素的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是采用以下步驟：
[0008] 1)在無菌環(huán)境中，用接種環(huán)挑取在固體斜面培養(yǎng)基上經(jīng)活化的細菌菌種，接種于 90~110mL液體活化培養(yǎng)基中，在27~30°C、轉(zhuǎn)數(shù)150~165r/min的搖床中培養(yǎng)24~ 36h，得到擴大培養(yǎng)的種子液；
[0009] 2)將步驟1)中得到的種子液，按照體積比5~15%的接種量接種于50mL液體發(fā) 酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵前期在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2. 5~10 %的水溶性高分子化合物，培養(yǎng) 液pH 5~7,在25~35°C下靜態(tài)發(fā)酵7~12d，得到未經(jīng)純化的細菌纖維素；
[0010] 3)將步驟2)中得到的未經(jīng)純化的細菌纖維素多次沖洗，去除表面雜質(zhì)及菌體，浸 泡于0. lmol/L NaOH溶液中，在80~100°C下水浴1~2h，蒸餾水反復沖洗，去除殘留NaOH 至細菌纖維素表面pH為中性，最終得到三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的細菌纖維素產(chǎn)品。
[0011] 所述的細菌菌種為：醋酸桿菌（AJ 12368)、木醋桿菌（ATCC 23769)、木醋桿菌 (CGMCC 1. 1812)中的一種。
[0012] 所述的水溶性高分子化合物為：羧甲基淀粉鈉、羥乙基纖維素、羥丙基淀粉中的一 種。
[0013] 所述的液體活化培養(yǎng)基配方為：28~32g/L葡萄糖、5~7g/L酵母浸膏、9~llg/ L蛋白胨、0.8~1.2g/L檸檬酸鈉、1.8~2. lg/L硫酸鎂、pH 6~7，121°C下高壓蒸汽滅菌 20min〇
[0014] 所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：68~72g/L蔗糖、10~12g/L酵母浸膏、27~29g/ L胰蛋白胨、0· 8~1. 2g/L檸檬酸三鈉、1. 8~2. 2g/L硫酸鎂、2. 5~2. 8g/L Na2HP04、l. 8~ 2. 2g/L ΚΗ2Ρ04、ρΗ 5 ~7,121°C下高壓蒸汽滅菌 20min。
[0015] 與【背景技術(shù)】相比，本發(fā)明具有的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明在發(fā)酵制備細菌纖維素的過程中引入醋酸桿菌（AJ 12368)、木醋桿菌 (ATCC 23769)和木醋桿菌（CGMCC 1. 1812)等細菌菌種，在靜態(tài)發(fā)酵初期加入水溶性高分 子化合物，使細菌在分泌纖維素時，原微細纖維保持分離狀態(tài)，破壞了原微細纖維聚集形成 纖維的過程，使細菌纖維素具有較均一的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進而提升了其化學反應(yīng)位點與活 性。方法簡單快速、成本低，對細菌纖維素的微觀形態(tài)具有較明顯的調(diào)控作用，進一步拓寬 了細菌纖維素產(chǎn)品的應(yīng)用價值和領(lǐng)域，為制備多元化細菌纖維素基功能材料奠定了原料基 礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0017] 圖1是由實施例1發(fā)酵制備的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細菌纖維素的形態(tài)照片。其中，圖1 (a) 是三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細菌纖維素的數(shù)碼照片，圖1(b)是三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)細菌纖維素的場發(fā)射掃 描電鏡照片。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0019] 實施例1:
[0020] 1)在無菌環(huán)境中，用接種環(huán)挑取在固體斜面培養(yǎng)基上經(jīng)活化的醋酸桿菌 (AJ12368)菌落，接種于100mL液體活化培養(yǎng)基中（液體活化培養(yǎng)基配方：28g/L葡萄糖、 5g/L酵母浸膏、9g/L蛋白胨、0. 8g/L檸檬酸鈉、1. 8g/L硫酸鎂、pH 6,121°C高壓蒸汽滅菌 20min)，在28°C、轉(zhuǎn)數(shù)160r/min的搖床中培養(yǎng)36h，得到擴大培養(yǎng)的種子液；
[0021] 2)將步驟1)中得到的種子液，按照體積比10%的接種量接種于50mL液體發(fā)酵培 養(yǎng)基中（液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方：68g/L鹿糖、10g/L酵母浸膏、27g/L胰蛋白胨、0. 8g/L梓檬 酸三鈉、1. 8g/L硫酸鎂、2. 5g/L Na2HP04、l. 8g/L KH2P04,121°C下高壓蒸汽滅菌 20min)，發(fā)酵 前期在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入5%的羥乙基纖維素，培養(yǎng)液pH 6,在25°C下靜態(tài)發(fā)酵7d，得 到未經(jīng)純化的細菌纖維素；
[0022] 3)將步驟2)