一種用redv多肽修飾的雙親梳型基因載體及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體及制備方法，屬于具有生 物靶向識(shí)別功能的基因載體技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類生命的最主要疾病之一。目前對(duì)心血管疾病的治療 主要是采用生物支架材料進(jìn)行人工血管構(gòu)建。但是隨著彈性回縮、內(nèi)膜增生和血管重構(gòu)等 機(jī)制的作用，支架材料術(shù)后往往引起再狹窄及血栓的發(fā)生，危及患者生命。對(duì)植入材料表 面實(shí)現(xiàn)良好的快速原位內(nèi)皮化是治療再狹窄及血栓的有效方法。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞具有 區(qū)別于其他種類細(xì)胞的細(xì)胞膜表面膜蛋白，因此利用這些特征的細(xì)胞表面膜蛋白構(gòu)建內(nèi)皮 細(xì)胞特異性識(shí)別支架材料，可以有效促進(jìn)其在體內(nèi)的特異性識(shí)別和快速粘附、增殖與分化。 REDV(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸）多肽能夠與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的α4β 1整合素 發(fā)生特異性的識(shí)別作用，使得REDV多肽在內(nèi)皮細(xì)胞中可以有效表達(dá)，從而提高支架材料在 內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附與增殖。
[0003] 使用帶有熒光活性的多肽，不僅能有效控制支架材料表面的多肽含量，而且為支 架材料在體內(nèi)的示蹤、成像提供了可能。
[0004] 基因治療是一種通過將目的基因轉(zhuǎn)移入機(jī)體的靶細(xì)胞而治療疾病的療法。采用轉(zhuǎn) 基因技術(shù)在促進(jìn)血管材料表面的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)方面的研究越來越受到廣泛關(guān)注。ZNF580基 因的表達(dá)可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)的表達(dá)，并使內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖活性明顯 增強(qiáng)。目前用于基因遞送的載體主要分為病毒類和非病毒類。由于非病毒類載體在性能及 安全方面的優(yōu)勢(shì)，在實(shí)際應(yīng)用中受到更多青睞。聚乙烯亞胺作為一種非病毒型陽(yáng)離子基因 載體，具有較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和轉(zhuǎn)染效率。但是高分子量的聚乙烯亞胺對(duì)生物體具有很高的 毒性，因此設(shè)計(jì)多位點(diǎn)的基因載體體系，使之能夠有效鏈接小分子量的聚乙烯亞胺，既能保 證有效運(yùn)載DNA，又能降低體系毒性，是廣大基因治療工作者努力的方向。
[0005] 聚合物類納米載體，由疏水性聚酯內(nèi)核和親水殼層組成，內(nèi)核的大小和殼層的長(zhǎng) 短，都可以通過調(diào)節(jié)聚合物的分子量得到很好的控制。而且選擇生物可降解的高分子聚合 物納米載體，在體內(nèi)降解過程中不會(huì)影響生物體內(nèi)的微環(huán)境，從而不會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生一系 列毒副作用。同時(shí)，親水殼層在體內(nèi)可以屏蔽多余的正電荷，有效促進(jìn)DNA從溶酶體中解離 出來，使其具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是在提供一種具有轉(zhuǎn)染活性高，生物靶向識(shí)別性能好，生物降解性 能佳，生物毒性低，體外檢測(cè)快捷方便的用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體的制備方 法。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0009] -種用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體，是用式（I)所示：
[0011] 其中：x+y = 10-114, x:y = (1-7) :1 ;
[0012] η = 27-40 ；
[0013] m = 45-114 ；
[0014] 43ml+86m2 = 1740 ；
[0015] REDVW是由精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-色氨酸構(gòu)成的多肽；
[0017] -種用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體的制備方法，包括如下步驟：
[0018] (1)帶苯環(huán)基的聚甲基丙烯酸羥乙酯梳型大分子引發(fā)劑（II)的制備：
[0019] 在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將甲基丙烯酸羥乙酯，催化劑溴化亞銅和2, 2' -聯(lián)吡啶，以及引 發(fā)劑1-溴乙基苯加入到溶劑無(wú)水丁酮中使溶解，密封后在液氮冷卻下，反復(fù)進(jìn)行抽真空、 通氮?dú)獠僮?-5次，在60-80°C反應(yīng)16-24h得混合液，混合液用二氯甲烷稀釋后過硅膠柱 或中性氧化鋁柱除去未反應(yīng)的溴化亞銅，然后用冰乙醚沉淀后真空干燥得到式（II)所示 的帶苯環(huán)基的聚甲基丙烯酸羥乙酯梳型大分子引發(fā)劑，所述甲基丙烯酸羥乙酯、溴化亞銅、 2, 2'-聯(lián)吡啶和1-溴乙基苯的摩爾比為（200-600) : (0· 8-1. 2) : (1. 6-2. 4) :1，其中x+y = 10-114 ；
[0020] (2)疏水性聚酯內(nèi)核（III)的制備：
[0021] 在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將式（II)所示的大分子引發(fā)劑加入到溶劑無(wú)水N，N_二甲基甲 酰胺或無(wú)水二甲基亞砜中使溶解，加入ε -己內(nèi)酯和起催化作用的辛酸亞錫密封后，反復(fù) 進(jìn)行抽真空、通氮?dú)獠僮?-5次，在110-140°C聚合反應(yīng)20-26h，冷卻到室溫，用二氯甲烷或 三氯甲烷溶解得到粗產(chǎn)物，粗產(chǎn)物經(jīng)冰甲醇或冰乙醚沉析、分離，沉淀物真空干燥后得到白 色的式（III)所示的疏水性聚酯內(nèi)核，所述ε -己內(nèi)酯與式（II)所示的大分子引發(fā)劑的 摩爾比為（30-45) :1,所述辛酸亞錫與ε-己內(nèi)酯的摩爾比為1 :(800-1200),其中：x+y = 10-114, η = 27-40 ；
[0022] (3)羧基端疏水性聚酯內(nèi)核（IV)的制備：
[0023] 在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將式（III)所示的疏水性聚酯內(nèi)核，丁二酸酐以及催化劑4-二 甲氨基吡啶，縛酸劑三乙胺加入到溶劑無(wú)水二氧六環(huán)或無(wú)水吡啶中使溶解，在室溫?cái)嚢璺?應(yīng)20-35 h，在冰甲醇或冰乙醚中沉析得到粗產(chǎn)物，真空干燥，干燥物用N，N-二甲基甲酰 胺或二甲基亞砜溶解，用截留分子量為5000-14000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍 干燥，得到白色的羧基端疏水性聚酯內(nèi)核（IV)，所述（III)所示的疏水性聚酯內(nèi)核、丁二酸 酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩爾比為1: (50-250) : (50-250) : (17-200)，其中：x+y = 10-114, η = 27-40 ;
[0024] (4)帶兩種親水段修飾的梳型聚合物（V)的制備：
[0025] 在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，將式（IV)所示的羧基端疏水性聚酯內(nèi)核、（1-(3-二甲氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基丁二酰亞胺、4-二甲氨基吡啶、分子量為2000-5000 的聚乙二醇單甲醚、分子量為1800的支鏈的聚乙烯亞胺以摩爾比1 :(30-200) :(20-135): (10-65) :(10-60) :(17-113)加入到混合溶劑中使溶解，在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18-28h，用截留分 子量為5000-14000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍干燥，得到白色的帶兩種親水 段修飾的梳型聚合物（V);其中 x+y = 10-114, x:y = (1-7) :1，η = 27-40, m = 45-114 ; 43ml+86m2 = 1740 ;所述混合溶劑由體積比為（1-5) :1的二甲基亞砜和二氯甲烷，或由體 積比為（1-5) :1的二甲基亞砜和三氯甲烷組成；
[0026] (5)在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，按比例將1質(zhì)量份的式（V)所示的帶兩種親水段修飾的梳型 聚合物和〇. 1-0. 2質(zhì)量份的分子量為2000的端基為吡啶二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的 異端聚乙二醇，加入到混合溶劑中使溶解，在暗室中于室溫下反應(yīng)2-4h，加入CREDVW多肽， 室溫下反應(yīng)4-6h，產(chǎn)物用截留分子量為5000-14000的透析管在蒸餾水中透析48-60h，冷凍 干燥，得到白色的用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體（I)，所述混合溶劑為體積比1:1的 pH = 7. 4的0. lmol/L磷酸緩沖溶液和二甲基亞砜；所述CREDVW為半胱氨酸-精氨酸-谷 氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-色氨酸；所述CREDVW多肽與所述分子量為2000的端基為吡啶 二硫基和琥珀酰亞胺酯基修飾的異端聚乙二醇的質(zhì)量比為（0. 17-0. 35) :1 ;
[0027] 反應(yīng)路線為：
[0029] 其中：x+y = 10-114, x:y = (1-7) : 1 ;
[0030] η = 27-40 ；
[0031] m = 45-114 ;
[0032] 43ml+86m2 = 1740 ；
[0034] REDVW是由精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-色氨酸構(gòu)成的多肽。
[0035] 本發(fā)明的一種用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體可以負(fù)載基因，生物毒性低， 靶向識(shí)別性能好。由聚甲基丙烯酸羥乙酯構(gòu)成的大分子主鏈可以有效鏈接小分子量的聚乙 烯亞胺陽(yáng)離子載體，使其可以高效負(fù)載基因。聚合物表面的親水殼層聚乙二醇可以屏蔽多 余的正電荷，有效促進(jìn)DNA從溶酶體中解離出來，提高其轉(zhuǎn)染效率。REDV多肽可以有效與內(nèi) 皮細(xì)胞膜表面的蛋白結(jié)合，提高聚合物材料在內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附。同時(shí)可以通過熒光的 方法檢測(cè)鏈接在聚合物表面的多肽含量，為本發(fā)明的基因載體在生物體內(nèi)的示蹤、成像提 供了可能。
【附圖說明】
[0036] 圖1為帶苯環(huán)基的聚甲基丙烯酸羥乙酯梳型大分子引發(fā)劑（II)的1H NMR圖，圖 中出現(xiàn)了該引發(fā)劑結(jié)構(gòu)中存在的各種氫質(zhì)子核磁共振峰，證明了所制備產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)組成。
[0037] 圖2為疏水性聚酯內(nèi)核（III)的1H NMR圖，圖中出現(xiàn)了該疏水性聚酯內(nèi)核結(jié)構(gòu)中 存在的各種氫質(zhì)子核磁共振峰，證明了所制備產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)組成。
[0038] 圖3為羧基端疏水性聚酯內(nèi)核（IV)的1H NMR圖，圖中出現(xiàn)了該羧基端疏水性聚 酯內(nèi)核結(jié)構(gòu)中存在的各種氫質(zhì)子核磁共振峰，證明了所制備產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)組成。
[0039] 圖4為帶兩種親水段修飾的的梳型聚合物（V)的1H NMR圖，圖中出現(xiàn)了這種帶兩 種親水段修飾的梳型基因載體結(jié)構(gòu)中存在的各種氫質(zhì)子核磁共振峰，證明了所制備產(chǎn)物的 結(jié)構(gòu)組成。
[0040] 圖5為用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體的動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布圖。從圖中 可以看出納米粒粒徑分布均勻，平均粒徑在l〇〇nm左右。
[0041] 圖6為用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體的透射電鏡圖。從圖中可以看出納 米粒呈近圓形分布，干態(tài)下的平均粒徑在50nm左右。
[0042] 圖7為熒光性能比較圖，其中：1為帶兩種親水段修飾的梳型聚合物（V) ;2為用 REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體（I) ;3為CREDVW多肽；從圖中可以看出用REDV多肽修 飾的雙親梳形基因載體（I)在360nm處出現(xiàn)REDV多肽中色氨酸的發(fā)射峰，而未載多肽的帶 兩種親水段修飾的梳型聚合物（V)則在此處沒有發(fā)射峰出現(xiàn)，證明了 CREDVW多肽連接成 功。
[0043] 圖8為不同氮（載體）磷（基因）比時(shí)，用REDV多肽修飾的雙親梳形基因載體 與ZNF580基因混合物的凝膠成像電泳圖。從1-7分別是氮磷比為0,1，3, 5,10,15, 20