一種同時(shí)制備知母中四種藥效成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種同時(shí)制備知母中四種藥效成分的方 法，具體涉及通過(guò)聯(lián)用兩種分離材料實(shí)現(xiàn)對(duì)知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母 皂苷AllI制備分離。
【背景技術(shù)】
[0002] 知母為百合科（Liliacea)植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥 根莖，具有清熱瀉火、生津潤(rùn)燥的功效，臨床用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、 內(nèi)熱消渴、腸燥便秘。現(xiàn)代藥理研究表明其具有降血糖、抗老年癡呆、抗腫瘤、抗病原微生 物、抗血小板聚集、降血糖、解熱、抗炎生理活性（徐愛(ài)娟等，中藥材，2008, 31 (4) :624-628 ; YingliWang，et.JEthnopharmacol. 2014,153(1) :42-60)，知母中化學(xué)成分主要為雙苯P比 酮類(lèi)和留體皂苷類(lèi)，雙苯吡酮類(lèi)主要成分為新芒果苷（NMF)和芒果苷（MF)，留體皂苷類(lèi)主 要成分為知母皂苷B-II(TSB-II)、知母皂苷A-III(TSA-III)。芒果苷具有降糖、神經(jīng)保 護(hù)、抗氧化、改善記憶、抗腫瘤等藥理效應(yīng)，新芒果苷具有芒果苷相似的藥理作用，B-II具有 改善認(rèn)知、抗血栓、抗炎效果，A-III具有抗血小板聚集、抗腫瘤的藥理作用，且該四種成分 在藥材中含量較高，表明其具有潛在的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。因此，對(duì)此知母中這些成分進(jìn)行富集 純化具有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。
[0003] 采用大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)知母中總黃酮類(lèi)成分（段亮亮等，中醫(yī)研究， 2009,22(9) :20-22)和總皂苷類(lèi)成分（陳志紅等，應(yīng)用化工，2008, 37 (8) :841-843 ;胡洋葉 等，世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14(1) :1232-1236)富集；若通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂技 術(shù)得到單一化合物知母皂苷B-II、A-III多需要與硅膠柱層析、逆流色譜（Meng-ShunLiu， et.SeparationandPurificationTechnology138(2014) 138-143)、制備液相等技術(shù)聯(lián)用 才能實(shí)現(xiàn)純化，但受設(shè)備限制該工藝很難實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，同時(shí)成本較高；也有采用大孔吸 附樹(shù)脂對(duì)知母皂苷A-III(李志雄等，中成藥，2013, 35 (2) :411-413)、B-II(CN1693310A)分 離制備，但現(xiàn)有工藝存在分離制備成分只有一種成分、其他成分沒(méi)有綜合制備利用的問(wèn)題， 或者工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，很難實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。通過(guò)單一大孔吸附樹(shù)脂技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)對(duì) 知母中四種組分單一成分芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的同時(shí)分離。
[0004] 因此建立一種能同時(shí)制備知母中芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷 A-III的、對(duì)環(huán)境友好、分離低成本的方法顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是建立一種同時(shí)規(guī)?；蛛x制備知母中主要化學(xué)組分的方法，涉及一 種同時(shí)制備知母中四種藥效成分的方法，洗脫劑中避免使用其他有機(jī)溶劑，只使用含水乙 醇，在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境友好。
[0006] 本發(fā)明涉及通過(guò)聯(lián)用兩種分離材料實(shí)現(xiàn)對(duì)知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII 和知母皂苷AllI制備分離；
[0007] 本發(fā)明涉及同時(shí)分離制備知母中主要成分的分離方法，涉及聚酰胺-大孔樹(shù)脂聯(lián) 用對(duì)知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII制備分離；
[0008] 本發(fā)明涉及同時(shí)制備知母中四種藥效成分的方法，先通過(guò)聚酰胺洗脫，再通過(guò)大 孔樹(shù)脂柱洗脫，同時(shí)分離制備知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方 法。
[0009] 本發(fā)明涉及同時(shí)分離制備知母中主要成分的分離方法，其包括：知母用乙醇提取， 知母乙醇提取物用聚酰胺吸附，用乙醇洗脫；然后加到大孔樹(shù)脂柱中，用乙醇洗脫，制備得 到知母中四種藥效成分。
[0010] 本發(fā)明涉及同時(shí)分離制備知母中主要成分的分離方法，其包括：知母用乙醇提取， 知母乙醇提取物回收乙醇后，用聚酰胺吸附，水洗除雜，用乙醇洗脫；乙醇洗脫物濃縮后，然 后加到大孔樹(shù)脂柱中，用乙醇洗脫，制備得到知母中四種藥效成分。
[0011] 本工藝的特征工藝是聚酰胺-大孔樹(shù)脂的連接方式，具體是通過(guò)兩種分離材料的 聯(lián)用實(shí)現(xiàn)分離，即知母乙醇提取液回收醇后的樣品水溶后是先通過(guò)聚酰胺，不同濃度乙醇 洗脫部位回收醇后分別通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂分段收集。
[0012] 聚酰胺-大孔樹(shù)脂的優(yōu)選連接方式：先通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂，分別用5% -20%乙醇和 40% -60%乙醇洗脫，分段后回收乙醇，然后分別采用不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫大孔樹(shù)脂 柱，大孔樹(shù)脂柱采用低濃度乙醇為20% -30%乙醇，中濃度乙醇為50% -60%乙醇，高濃度 乙醇為70% -80%乙醇洗脫，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)四種組分的規(guī)?；苽?。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：知母乙醇提取物不能通過(guò)"先通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂，再通過(guò)聚 酰胺"而實(shí)現(xiàn)新芒果苷、知母皂苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII的有效完全分離。
[0014] 本發(fā)明涉及同時(shí)分離制備知母中主要成分的分離方法，其包括：
[0015] a)將市售的知母藥材或飲片直接投料或粉碎成粗粉，以3-10倍體積的30% -80% 的乙醇室溫超聲提取1-3次，每次0. 5-lh，或者通過(guò)加熱方式超聲提取或回流提取1-3次， 每次l_3h，過(guò)濾，合并提取液回收乙醇后加水溶解到適當(dāng)體積，得提取液。
[0016] b)上述提取液通過(guò)預(yù)處理好的聚酰胺柱，先后采用5% -20 %乙醇和40% -60% 乙醇溶劑1_5BV(BV為填料的裝柱體積，如聚酰胺柱體積為30mL，1-5BV就是洗脫劑要用 30-150mL，下同）洗脫。第一部分包括上樣流出溶液和5% -20%乙醇洗脫溶液，記作樣1 ; 第二部分為40% -60%乙醇洗脫溶液，記作樣2。
[0017] c)取樣1濃縮至無(wú)醇味，加水至3-10倍體積至充分溶解，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，分 另IJ用水、不同濃度乙醇洗脫。收集低濃度乙醇洗脫部位，記作樣3,中濃度洗脫部位，記作樣 4〇
[0018] d)取樣2濃縮到無(wú)醇味，加水適量至充分溶解，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，分別以低濃 度、中濃度和高濃度乙醇洗脫，收集低濃度醇洗脫部位，記作樣5 ;高濃度乙醇洗脫部位，記 作樣6。
[0019] e)取樣3、樣4、樣5、樣6,濃縮，真空干燥或冷凍干燥，分別得到新芒果苷、知母皂 苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII。
[0020] 步驟b)中聚酰胺為30-60目或者60-100目。
[0021] 步驟c)中大孔吸附樹(shù)脂為中極性、弱極性或非極性吸附樹(shù)脂，如D101、HPD100、 AB-8、HPD400、HPD600等，低濃度乙醇濃度范圍為10% -30%乙醇，中濃度乙醇濃度范圍為 40% -50% 乙醇。
[0022] 步驟d)中大孔吸附樹(shù)脂為中極性、弱極性或非極性吸附樹(shù)脂，如D101、HPD100、 AB-8、HPD400、HPD600等，低濃度乙醇濃度范圍為20% -30%乙醇，中濃度乙醇濃度范圍為 50% -60 %乙醇，高濃度乙醇濃度范圍為70% -80 %乙醇。
[0023] 在上述描述中，上樣流速為l_3BV/h，洗脫流速l_2BV/h，洗脫劑體積為柱體積的 1-3 倍。
[0024] 聚酰胺-大孔樹(shù)脂的連接方式：連接方式可以通過(guò)一定管線(xiàn)連接以實(shí)現(xiàn)流水化。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用乙醇提取，采用聚酰胺和大孔吸附樹(shù)脂聯(lián)用技術(shù)同 時(shí)分離制備知母中四種主要成分、芒果苷（MF)、新芒果苷（NMF)、知母皂苷BII(TSB-II)和 知母皂苷AIII(TSA-III)，有效避免單一提取帶來(lái)的資源浪費(fèi)，提高資源利用效率，且使用 的分離材料可以再生處理，洗脫劑為含水乙醇。工藝生產(chǎn)成本低，綠色環(huán)保，純度大于90%， 易于規(guī)?；a(chǎn)。知母乙醇提取濃度考察：由表1看出，30% -70%乙醇提取溶劑可以提取 絕大部分成分，綜合考慮到雜質(zhì)含量等，以70%乙醇作為提取溶劑。
[0026] 表1不同乙醇濃度考察結(jié)果（η= 2)
[0027]
[0028] 大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)考察：
[0029] 分別量取預(yù)處理好的18種大孔吸附樹(shù)脂各lg(干重），加樣品溶液100mL，放入搖 床中25°C下回旋震蕩12h，濾除溶液，依次分別用水10mL，80%乙醇20mL震蕩洗脫2h，測(cè)定 芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的含量，計(jì)算比吸附量和解吸率，結(jié)果 見(jiàn)表2,綜合考慮到吸附量、解吸率和樹(shù)脂價(jià)格，選擇HPD-100,HPD-400,HPD-600做進(jìn)一步 考察。
[0030] 表2樹(shù)脂靜態(tài)考察
[0031]
[0032] 分別取相當(dāng)于干重8g的HPD-100,HPD-400,HPD-600大孔吸附樹(shù)脂，裝于 Φ20X300mm層析柱中，取生藥濃度1 : 10知母提取溶液200mL以2.OBV/h流速通過(guò)聚酰 胺樹(shù)脂柱，然后分別以去離子水、10 %、20 %、30 %、40 %、50 % 60 %、70 %、80 %乙醇各80mL 以1.OBV/h進(jìn)行洗脫，80mL分段進(jìn)行收集，測(cè)定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂 苷A-III。由表3可以看出，新芒果苷和芒果苷都不能在在三種大孔吸附樹(shù)脂上實(shí)現(xiàn)分離， 知母皂苷B-II與芒果苷洗脫曲線(xiàn)也有一定重合，知母皂苷A-III在三種樹(shù)脂上都能實(shí)現(xiàn) 分離。在本工藝考察中，芒果苷和知母皂苷B-II在中弱極性樹(shù)脂HPD400具有相對(duì)好的分 離效果。
[0033] 表3三種大孔吸附樹(shù)脂樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附考察
[0034]
[0035] 上樣質(zhì)量對(duì)四種組分在大孔吸附樹(shù)脂上分離影響：
[0036] 取預(yù)處理好的相當(dāng)于8g的HPD400大孔吸附樹(shù)脂裝入Φ20X300mm層析柱中，取 生藥濃度1 : 10知母提取溶液60mL，120mL，180mL分別以2.OBV/h通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱，然 后分別以水、10 %、20 %、30 %、40 %和50 %乙醇1.OBV/h進(jìn)行洗脫，每80mL分段進(jìn)行收集， 測(cè)定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。
[0037] 由表4可以看出，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III分別被 20% -30%乙醇、20% -50%乙醇、40% -60%乙醇和40% -60%乙醇洗脫，隨著上樣質(zhì)量的 增加，B-II與芒果苷的重合越來(lái)越多，為保持合適的分離效率，故上樣量以不超過(guò)180mL為 宜。
[0038] 表4不同上樣體積四種組分在HPD400上的洗脫特征
[0039]
[0040] 大孔吸附樹(shù)脂的型號(hào)對(duì)四種組分的分離并沒(méi)有決定性的影響，但因非極性吸附樹(shù) 脂如D101、弱極性吸附樹(shù)脂如AB-8和中極性吸附樹(shù)脂具有較大的吸附量，這些型號(hào)樹(shù)脂都 可以作為本工藝的分離樹(shù)脂。四種組分并不能實(shí)現(xiàn)在大孔吸附樹(shù)脂上有效分離。
[0041] 聚酰胺純化工藝中聚酰胺規(guī)格、廠(chǎng)家和乙醇洗脫濃度考察：分別取預(yù)處理好的臺(tái) 州四甲（臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠(chǎng)）產(chǎn)30-60目（T30-60)、60-100目（T60-100)聚酰胺 粉和寶