一種病毒滅活去除純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾制備收率高、效價穩(wěn)定、低病毒的烏司他丁的制備方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]烏司他丁(ULinastatin)系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α -糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子(MDF)產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對內(nèi)臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環(huán)狀態(tài)等。
[0003]1909年歐洲首先報道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應用于臨床。
[0004]本發(fā)明人自2008年開始對UTI的生產(chǎn)工藝進行試驗研究，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價不低于5000iu/mg，柱效提高約50%。近期我們組織相關(guān)人員進行科研攻關(guān)，最終采用低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾來純化烏司他丁，病毒去除率不低于41og，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種病毒滅活去除純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過低、效價不高不穩(wěn)定、病毒指標不明的缺點，采用低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾來純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價的穩(wěn)定及用藥安全性。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
一種病毒滅活去除純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁穩(wěn)定性的藥物組合物，其特征在于:選用采用低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾來純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，病毒去除率不低于41og。
[0007]該技術(shù)方案中，其技術(shù)特征還在于所述方法包括如下步驟:
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0008]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)
2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，反復多次，純化水浸沒過夜；
2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5 mol/L鹽酸浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性；
2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用；
2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱；
2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60 °C水浴攪拌加熱10小時；
2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；
2.7)用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；
2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
[0009]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在120~130mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，流速120~130mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120~130mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續(xù)超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至相同體積。
[0010]4)沉淀
超濾液中按1:6的比例加入-20°C以下、95%以上的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
[0011]5)病毒滅活去除
將上述沉淀物用無水乙醇溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH3?6，在18?25°C條件下培育15?30天，切向流超濾，離心。
[0012]6)凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得烏司他丁。
[0013]經(jīng)核算，所得烏司他丁總收率高達70%以上，按中國藥典所示方法測定，總效價高達5000iu/mg以上，柱效提高約50%，病毒去除率不低于41og。。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
選用病毒滅活去除法純化烏司他丁，可以更有效的去除烏司他丁中的多種雜蛋白及病毒，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而使產(chǎn)品的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得烏司他丁總收率達到70%以上，總效價不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，病毒去除率不低于41og，節(jié)約了成本，提高了用藥安全性，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
[0015]
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，而不以任何方式限制。
[0017]實施例1
1)烏司他丁粗加工
稱取IT pH 6.0的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。
[0018]2)吸附柱層析(以0.25L DEAE樹脂柱為例)
2.1)將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置1小時，傾去上清液及細小顆粒，反復三次，純化水浸沒過夜；
2.2)將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5 mol/L鹽酸浸沒，攪拌1小時，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5 mol/L NaOH溶液浸泡，攪拌1小時，過濾，再用純化水洗至中性；
2.3)將上述經(jīng)處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用；
2.4)將上述平衡好的樹脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱；
2.5)稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60 °C水浴攪拌加熱10小時；
2.6)將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在125mL/min左右；
2.7)用37L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；
2.8)將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.85L。
[0019]3)親和層析(以0.25L柱體為例)
3.1)用3.5L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過的樹脂柱，流速控制在125mL/min ；
3.2)上樣結(jié)束后，用12L的洗脫液C洗脫，流速125mL/min左右，收集洗脫液；
3.3)柱中的親和樹脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用8.0L的洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在125mL/min，密封待用；
3.4)洗脫液經(jīng)超濾膜超濾至190mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液850mL，繼續(xù)超濾至190mL，然后再加入850mL磷酸氫二鈉溶液，再經(jīng)超濾膜超濾至190mL。
[0020]4)沉淀