與人血管內(nèi)皮生長因子特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及與人血管內(nèi)皮生長因子特異性 結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段及其用途。進一步，本發(fā)明涉及與人血管內(nèi)皮生長因子特異 性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段、分離的多核苷酸、制備該抗體或其抗原結(jié)合片段的方法、 雜交瘤、雜交瘤在制備單克隆抗體中的用途、包含該抗體或其抗原結(jié)合片段、該多核苷酸或 該雜交瘤的藥物組合物、用于鑒定能夠與人血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合的藥物的方法、藥物聯(lián) 合。
【背景技術(shù)】
[0002] 1971年Folkman首先觀察到當腫瘤體積超過l-2mm3,需要新血管的形成來維持生 長，從而最早提出腫瘤生長是血管依賴性的，并指出抗血管生成是控制腫瘤生長的新途徑。 已有研究表明，幾乎所有實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移都依賴于腫瘤新血管的生成。
[0003] 1989 年FerraraN發(fā)現(xiàn) 了血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowth factor，VEGF)，后來被證明是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的血管形成因子之一，在腫瘤的血管生長 中發(fā)揮著重要作用。對腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有重要影響，在腫瘤的血管發(fā)生過程中發(fā)揮極其 重要的作用。VEGF既可以用于腫瘤治療的理想靶點，也可以作為進行腫瘤診斷和判斷預后 的標志物。VEGF是相對分子質(zhì)量34000-42000Da的高度糖基化堿性同源二聚體糖蛋白，其 編碼基因位于染色體的6q21. 3,全長14kb，含有8個外顯子和7個內(nèi)含子，可形成9種異構(gòu) 體，主要包括VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206。其中多數(shù)組織以表達VEGF165為主。
[0004] VEGF和VEGFR2之間的結(jié)合是腫瘤血管生成的關(guān)鍵，阻斷他們之間的"同形體"則 抑制腫瘤血管生成?？筕EGFR2抗體對比貝伐單抗，可同時阻斷VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E的作用，具有更有效的抗血管生成效果，因而對腫瘤在體內(nèi)轉(zhuǎn)移具有特別抑制性。 [0005] 然而，目前特異性識別VEGF的抗體仍有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種有用的商 業(yè)選擇。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠特異性與人血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合的 抗體或其抗原結(jié)合片段及其用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種與人血管內(nèi)皮生長因子（huVEGF，在本文 中如無特別說明，VEGF指的是人血管內(nèi)皮生長因子）特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片 段。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該抗體或其抗原結(jié)合片段包括：具有下列至少之一氨基酸序列的 重鏈可變區(qū)：（1)SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列（GYTFTNYGLN)，（2)SEQIDN0 :2所示的氨 基酸序列（WINTYTGEPTYADDFKG)，（3)SEQIDN0:3 所示的氨基酸序列（YGITYEWYFDV)，（4) 與（1)~（3)相比具有一個以上氨基酸保守突變的氨基酸序列。序列可以包含某些生物學 功能等同的氨基酸或"保守性替代"，其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或"非保守性 替代"，其經(jīng)基因工程改造以改進⑶R或含⑶R抗體的特性。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，該抗體或其抗原結(jié)合片段可以進一步包括：具有下列至少 之一氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)：（5)SEQIDN0 :4所示的氨基酸序列（RASQDISNSLN)，（6)SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列（YTSRLHS)，（7)SEQIDNO:6所示的氨基酸序列（QQGNTFPWT)， (8) 與（5)~（6)相比具有一個以上氨基酸保守突變的氨基酸序列。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，該抗體或其抗原結(jié)合片段的所述重鏈可變區(qū)具有如SEQID NO:7 所示的氨基酸序列（EVKLQESGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGLNWVKQAPGKGLKWMGWINTY TGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCAKYGITYEffYFDVffGAGTTVTVSS)〇
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，該抗體或其抗原結(jié)合片段的所述輕鏈可變區(qū)具有如SEQID NO:8 所示的氨基酸序列（DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNSLNWYQQKPNGTVILLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGAVYSLTISDLEQEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIKR)〇 [0011] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，該抗體或其抗原結(jié)合片段的所述抗體為單克隆抗體。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體或 其衍生物。
[0013] 發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明實施例的抗體或其抗原結(jié)合片段，能夠特異性識別 人血管內(nèi)皮生長因子，并且能夠有效地阻斷人血管內(nèi)皮生長因子與其受體的結(jié)合，進而阻 斷人血管內(nèi)皮生長因子受體例如VEGFR1或2的相關(guān)信號通路，從而可以有效地抑制腫瘤的 增長。
[0014] 在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的多核苷酸，根據(jù)本發(fā)明的實施例， 該多核苷酸編碼前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的實施例，前面所描述的多核苷酸，包含：重鏈可變區(qū)編碼序列，所述 重鏈可變區(qū)編碼序列具有如SEQIDN0 :9所示的核苷酸序列或其互補序列

和/或輕鏈可變區(qū)編碼序列，所述輕鏈可變區(qū)編碼序列具有如SEQIDN0 :10所示的核 苷酸序列或其互補序列

[0016] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，能夠有效地合成根據(jù)本發(fā)明實施 例的特異性識別人血管內(nèi)皮生長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于特異性識別人血管內(nèi) 皮生長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，前面所描述的特征和優(yōu)點同樣適用該多核苷酸，在 此不再贅述。
[0017] 在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段 的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，包括：使宿主細胞表達前面所述的多核苷酸。
[0018] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠利用前面所述的多核苷酸有效地 合成根據(jù)本發(fā)明實施例的特異性識別人血管內(nèi)皮生長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于 特異性識別人血管內(nèi)皮生長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，前面所描述的特征和優(yōu)點同樣 適用該方法，在此不再贅述。
[0019] 在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種雜交瘤（雜交瘤細胞株WS006)，其以保 藏號CCTCC:C2014111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏時間：2014年6月10 日。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用根據(jù)本發(fā)明的雜交瘤，能夠有效地合成根據(jù)本發(fā)明實施例的特異 性識別人血管內(nèi)皮生長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于特異性識別人血管內(nèi)皮生長因 子的抗體或其抗原結(jié)合片段，前面所描述的特征和優(yōu)點同樣適用該雜交瘤，在此不再贅述。
[0020] 在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了前面所述的雜交瘤在制備單克隆抗體中的用 途。
[0021] 明人發(fā)現(xiàn)，通過采用根據(jù)本發(fā)明的雜交瘤，能夠有效地合成根據(jù)本發(fā)明實施例的 特異性識別人血管內(nèi)皮生長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段。關(guān)于特異性識別人血管內(nèi)皮生 長因子的抗體或其抗原結(jié)合片段，前面所描述的特征和優(yōu)點同樣適用該多用途，在此不再 贅述。
[0022] 在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、前面的 多核苷酸、或前面所述的雜交瘤在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療癌癥或者抑制腫 瘤增殖。任選的，所述癌癥為黑色素瘤或肺癌。
[0023] 在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了一種藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該藥 物組合物包含前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段、前面的多核苷酸、或前面所述的雜交瘤。
[0024] 在本發(fā)明的第八方面，一種用于鑒定能夠與人血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合的藥物的方 法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：
[0025] 在候選藥物存在時，使前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原接觸，并且確定 所述抗體或其抗原結(jié)合片段與所述抗原的第一結(jié)合量，其中，所述抗原為人血管內(nèi)皮生長 因子或其片段；以及
[0026] 在不存在所述候選藥物時，使前面所述的抗體或其抗原結(jié)合片段與抗原接觸，并 且確定所述抗體或其抗原結(jié)合片段與所述抗原的第二結(jié)合量，其中，所述抗原為人血管內(nèi) 皮生長因子或其片段，
[0027] 其中，所述第二結(jié)合量大于所述第一結(jié)合量是候選藥物能夠與人血管內(nèi)皮生長因 子結(jié)合的指示。
[0028] 由此，通過采用該方法，能夠篩選與人血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合的候選藥物。
[0029] 在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種藥物聯(lián)合。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該藥物