一種紫丁香蘑菌株及其液體菌種與制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種紫下香磨菌株及其液體菌種與制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫下香磨η化/a度ull.)Cooke]是一種香味濃郁，色澤艷麗，營養(yǎng)豐富 的食用菌，在發(fā)過被公認(rèn)為上等食物。不僅如此，紫下香磨在抗癌試驗(yàn)中還表現(xiàn)出對小白鼠 腫瘤的抑制高達(dá)90%，對艾氏癌的抑制率更是高達(dá)100%。但是目前市場上的菌種都是出于 壟斷地位的法國的紫下香磨的菌種，而我國自己的紫下香磨菌種還是稀缺的，運(yùn)主要是由 于我們的菌種性狀不穩(wěn)定，菌種的獨(dú)特性導(dǎo)致培養(yǎng)方法與法國菌種培養(yǎng)方法不盡相同，因 此我們迫切需要研究出我國自己的菌株，打破法國在紫下香磨菌種的壟斷地位，并研究出 相應(yīng)的培養(yǎng)方法，進(jìn)行配套的生產(chǎn)栽培技術(shù)，有效的提高我們的紫下香磨的產(chǎn)量等。
[0003] 在紫下香磨的優(yōu)良菌種的獲得是關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)大多采用固體制種技 術(shù)，而很少使用液體發(fā)酵。對于固體制種技術(shù)而言，液體發(fā)酵技術(shù)具有具有菌絲生長良好、 菌球均勻、性狀穩(wěn)定，較少污染、培養(yǎng)基利用充分的優(yōu)點(diǎn)。本專利采用液體發(fā)酵技術(shù)制作品 質(zhì)優(yōu)良、性狀穩(wěn)定的液體菌種，對后期人工栽培和醫(yī)學(xué)研究提供保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明第一目的在于提供一種紫下香磨菌株，第二目的在于提供一種紫下香磨 M-012#的液體菌種，第Ξ目的在于提供所述紫下香磨M-012 #的液體菌種的制備方法。
[0005] 本發(fā)明第一目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的，所述的紫下香磨菌株為紫下香磨M-012#菌株，保 藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏日：2015年8月21 日，保藏編號：CGMCCNo. 11206 ;所述紫下香磨M-012#菌株屬于真菌界，擔(dān)子菌口，傘菌綱， 傘菌目，口磨科，香磨屬。
[0006] 紫下香磨M-012#菌株的獲得與鑒定 1、將采集的紫下香磨子實(shí)體內(nèi)壁組織塊接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，于18~24°C下 培養(yǎng)5~lOd，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管，挑選出無污染、長勢 良好且菌核生成能力強(qiáng)的菌株，獲得紫下香磨分離試管種，所述的試管瓊脂培養(yǎng)基的配方： 馬鈴馨16g，葡萄糖1.6g，KH2PO40.〇3g，瓊脂1.6g，Μ拆〇40. 02g，蒸饋水100ml，抑7. 0 ;培 養(yǎng)溫度20~28 °C。
[0007] 2、將紫下香磨分離試管種菌絲體接種到平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化，培養(yǎng)條件為 18~24°C下避光，所述的瓊脂培養(yǎng)基的配方：馬鈴馨16g，葡萄糖1.6g，KH2PO40.〇3g，瓊脂 1.6g，M拆〇40.02g，蒸饋水100ml，抑7. 0;培養(yǎng)溫度20~28°C;2d后取尖端菌絲塊接種在培 養(yǎng)基斜面上，所述的培養(yǎng)基配方：馬鈴馨16g，葡萄糖1.6g，KH2PO40.〇3g，瓊脂1.6g，Μ拆〇4 0.02g，蒸饋水100ml，抑7. 0;于18~24°C下培養(yǎng)5~7d，獲得紫下香磨純化試管種。
[0008] 3、采用供試子實(shí)體與對應(yīng)菌絲分離物，分別按CTAB方法提取紫下香磨總DNA，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增及ITS序列測定，將所測得試驗(yàn)樣品的ITS序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST序 列比對分析，與NCBI中的紫下香磨（Z.Λ化劫序列Identities= 606/606(100%)，Gaps= 0/606 (0%)，分析確定分離得到的純培養(yǎng)物為本發(fā)明所述的紫下香磨（Z.nw/a)菌絲體。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：一是菌絲體生物量高，可達(dá)28g/Kg，而固 體菌包菌絲體生物量大約在6~13g/Kg ;二是菌絲生長速度快，在直徑10cm的平板上菌絲 只要7d就可W長滿平板；Ξ是培養(yǎng)污染率低，《2%。同時(shí)采用液體發(fā)酵法時(shí)間短，大約 72~9化，而普通的固體包培養(yǎng)需要15dW上。
[0010] 本發(fā)明利用云南原產(chǎn)地紫下香磨子實(shí)體篩選出優(yōu)良菌株，為紫下香磨人工栽培提 供優(yōu)良菌種。
[0011] 本發(fā)明所提供的紫下香磨M-012#菌株保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中屯、；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏日期：2015年08月21日； 保藏登記入冊的編號CGMCCNO. 11206。
[0012] 本發(fā)明第二目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的，是W所述紫下香磨菌株M-012#經(jīng)斜面培養(yǎng)、種子 培養(yǎng)、發(fā)酵后制成的液體菌種。
[0013] 本發(fā)明的第Ξ目的是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的，包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵步驟，具體包 括： A、 斜面培養(yǎng)：將紫下香磨菌株M-012#的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在溫度 為18~24°C下培養(yǎng)5~7山得試管菌種； B、 種子培養(yǎng)：將試管菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度為20~26°C下?lián)u床培養(yǎng)5~lid， 得液體發(fā)酵種子； C、 發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)5~9%的量接種入發(fā)酵罐，在罐壓 0. 03~0. 05MPa，溫度21~23°C，pH值7. 0~8. 0,攬拌速度130~150r/min，通氣量70~90〇/〇下 培養(yǎng)80~90h，得到紫下香磨M-012#的液體菌種。
[0014] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是：一是從紫下香磨（Z.nw/a)發(fā)生地一一云南省昆明市 雙龍鄉(xiāng)野鴨湖野生附近生長的該菌的子實(shí)體進(jìn)行組織分離培養(yǎng)得到，具有明顯的地域性特 征；二是克服現(xiàn)有技術(shù)菌絲生長不均勻、污染率高、培養(yǎng)基利用不充分等不足。其目的是提 供一種具有產(chǎn)量高、菌絲生長快速、抗污染的新的優(yōu)良紫下香磨菌株及其培養(yǎng)方法。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：一是菌絲體生物量高，可達(dá)28g/Kg，而固體菌包菌絲體生 物量大約在6-13g/Kg ;二是菌絲生長速度快，在直徑10cm的平板上菌絲只要7d就可W長 滿平板；Ξ是培養(yǎng)污染率低，《2%。同時(shí)采用液體發(fā)酵法時(shí)間短，大約72~9化，而普通的固 體包培養(yǎng)需要15dW上。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不W任何方式對本發(fā)明加W限制， 基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0017] 本發(fā)明所述的紫下香磨菌株為紫下香磨M-012#菌株，保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、（CGMCC)，保藏日：2015年8月21日，保藏編號：CGMCC No. 11206;所述紫下香磨M-012#菌株屬于真菌界，擔(dān)子菌口，傘菌綱，傘菌目，口磨科，香磨 屬。
[0018] 本發(fā)明所述的紫下香磨M-012#的液體菌種，是W所述紫下香磨菌株M-012#經(jīng)斜面 培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵后制成的液體菌種。
[0019] 本發(fā)明所述的紫下香磨M-012#的液體菌種的制備方法，包括斜面培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、 發(fā)酵步驟，具體包括： A、 斜面培養(yǎng)：將紫下香磨菌株M-012#的菌絲體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在溫度 為18~24°C下培養(yǎng)5~7山得試管菌種； B、 種子培養(yǎng)：將試管菌種接種到液體培養(yǎng)基中，在溫度為20~26°C下?lián)u床培養(yǎng)5~lid， 得液體發(fā)酵種子； C、 發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子按發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)5~9%的量接種入發(fā)酵罐，在罐壓 0. 03~0. 05MPa，溫度21~23°C，pH值7. 0~8. 0,攬拌速度130~150r/min，通氣量70~90〇/〇下 培養(yǎng)80~90h，得到紫下香磨M-012#的液體菌種。
[0020] A步驟中所述的試管瓊脂培養(yǎng)基為改良PDA培養(yǎng)基，其成分為：馬鈴馨15~17g，葡 萄糖1. 5~1. 7邑，皿2口〇4 0. 02~0. 04g，瓊脂1. 5~1. 7g，M拆〇40. 01~0. 03g，其余為水，抑值為 7. 0。
[0021]B步驟中所述的液體培養(yǎng)基的成分為：教皮5~lOg，黃豆粉0.5~Ig，麥芽糖 0. 5~Ig，可溶性淀粉1~2g，其余為水，抑值為7.0。
[0022] C步驟中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為：教皮5~lOg，黃豆粉0.5~Ig，麥芽糖 0. 5~Ig，可溶性淀粉1~2g，其余為水，抑值為7.0~8.0。
[0023] 下面通過實(shí)施例加W說明： 下述實(shí)施例中使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0024] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[00巧]W下實(shí)施例野生紫下香磨在云南省昆明市雙龍鄉(xiāng)野鴨湖邊采集；采集方法為徒手 采集，采集時(shí)候注意保持子實(shí)體完整、無霉變、無病蟲害。
[0026] 實(shí)施例1 1.1紫下香磨M-012#的獲得 (1)將采集的野生紫下香磨子實(shí)體切成塊即組織塊，將組織塊接種到菌種分離純化培養(yǎng) 基斜面上，于18°C下培養(yǎng)lOd，對分離培養(yǎng)的試管每天觀察記錄，及時(shí)剔除已污染的試管， 挑選出無污染、長勢良好的菌株，獲得紫下香磨分離試管種；所述的菌種分離純化培養(yǎng)基的 配方為： 似將紫下香磨分離試管種菌絲塊接種到瓊脂培養(yǎng)基的平板培養(yǎng)皿上進(jìn)行菌種純化， 培養(yǎng)條件為18~24°C避光，所述的瓊脂培養(yǎng)基的配方：馬鈴馨30g，葡萄糖2g，K2HPO4O. 5邑， 瓊脂2g，蒸饋水100ml，pH7. 0,培養(yǎng)溫度20~25°C;2d后取尖端菌絲塊接種在培養(yǎng)基斜面 上，于18°C下培養(yǎng)7山獲得紫下香磨純化試管種即為獲得的新的紫下香磨菌株，所述的培 養(yǎng)基配方法：馬鈴馨30g，葡萄糖2g，K2HPO4O. 5g，瓊脂2g，蒸饋水100ml，pH7. 0,培養(yǎng)溫度 20~25°C。
[0027] 通過菌絲體產(chǎn)量、菌核生成能力、抗污染力等性狀比對，挑選出菌絲體產(chǎn)量高、菌 核生成能力強(qiáng)、抗污染的紫下香磨液體菌種專用菌株M-012#。
[0028] 1. 2鑒定及其特征、命名、保藏 (1)子實(shí)體特征 M-012# 分離用子實(shí)體特征為：菌蓋直徑3. 5~10cm，半球形至平展，有時(shí)中部下凹，亮紫色或下 香紫色變至褐紫色，光滑，濕潤，邊緣內(nèi)卷，無條紋。菌肉淡紫色，較厚。菌權(quán)紫色，密，直生 至稍延生，不等長，往生邊緣呈小銀齒狀。菌柄長4~9畑1，粗0. 5~2畑1，圓柱形，同菌蓋色，初 期上部有絮狀粉末，下部光滑或具縱條紋，內(nèi)實(shí)，基部稍膨大。抱子印肉粉色。抱子無色，楠 圓形，近光滑，具有小麻點(diǎn)，5.0~7.5μmX3.0~5.0μm。形態(tài)鑒定參考《中國大型真菌》（卯 曉試.鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000.)。
[0029] 似紫下香磨M-012#菌株純化試管種特征 接種后，在培養(yǎng)溫度為22°C的條件下，1化就開始萌發(fā)，生長初期菌絲緊貼培養(yǎng)基， 無色，有光澤，一般為較粗的不分支或分支較少的菌絲；第一天長速最快為1.1cm，最慢為 0. 3cm，而后隨菌落的增大，有叉狀或樹枝狀分支，一般較細(xì)，前兩天無菌核與色素產(chǎn)生，第 Ξ天生長最快，平均長速為0. 70cm/d，并開始有色素產(chǎn)生，第九天到第十天長滿整個(gè)培養(yǎng) 皿。
[0030] (3)ITS序列分析 采用供試野生紫下香磨子實(shí)體與實(shí)施例1獲得的對應(yīng)的紫下香磨純化試管種菌絲，分 別按CTAB法提取總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及口S序列測定，通過Blast對比樣品的口S序列與 NCBI中的紫下香磨（Z.Λ化劫序列Identities= 606/606(100%)，Gaps= 0/606(0%)，分析 確定實(shí)施例1分離得到的紫下香磨純化試管種即新的紫下香磨菌株為紫下香磨菌絲體。其 具體方法如下： 改良CTAB法流程 i稱取0. 12g左右的干燥樣品，加入液氮并迅速研磨至粉狀后，迅速加入-(：ΤΑΒ50〇μ1、β-琉基乙醇2〇μ1，再加+CTAB(65°C預(yù)熱）70〇μ1，混勻后置65°C水浴振蕩抽提60min; ii冷卻，1200化離