一種高純度瓊膠酶的制備工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高純度瓊膠酶的制備工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]瓊膠是一種從江籬、石花菜等紅藻中提取出來的水溶性多糖，主要由瓊膠糖和硫瓊膠兩部分組成，瓊膠糖是由1，3連接的β -D-半乳吡喃糖和1，4連接的3，6-內(nèi)醚-a -L-半乳吡喃糖殘基反復(fù)交替連接的鏈狀中性糖。硫瓊膠結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，含有D-半乳糖、3，6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸[I]。瓊膠酶能降解瓊膠多糖，這些降解產(chǎn)物在很多方面有重要應(yīng)用，而且，瓊膠酶在分子生物學(xué)等方面也多有應(yīng)用，因此，對于瓊膠酶的研究具有重要的意義。
[0003]用途也較為廣泛，可作為天然防腐劑、高甜度甜味劑的充填劑及分散劑、功能性食品基料、抗氧化劑、在藥物方面的應(yīng)用，利用瓊膠酶開發(fā)瓊脂低聚糖產(chǎn)品，可極大地拓寬瓊脂在食用和醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用。為了能充分發(fā)揮瓊膠酶及其酶解產(chǎn)物在國民經(jīng)濟(jì)中的作用，進(jìn)一步提升我國人民的健康水平，今后的工作重點(diǎn)應(yīng)是加強(qiáng)瓊膠酶的基礎(chǔ)性研究，拓寬瓊膠酶的來源，大力開發(fā)瓊膠酶酶解產(chǎn)物中具有活性功能的物質(zhì)，力求形成一個(gè)新的產(chǎn)業(yè)，一個(gè)新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。
[0004]迄今為止，有少數(shù)幾種瓊膠酶的基因得到了克隆和測序，目前研究證實(shí)，即使有些β -瓊膠酶的功能相似，但它們的氨基酸序列、分子量、底物特異性、反應(yīng)特性等方面存在著很大的差異。由于缺乏瓊膠酶，瓊脂酶和瓊脂低聚糖制備工藝技術(shù)在國內(nèi)尚為空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了高純度瓊膠酶的制備工藝，使得瓊膠酶的制備工藝制得高高純度瓊膠酶，純化效率得到提高，便于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)與推廣。
[0006]為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種高純度瓊膠酶的制備工藝，制備工藝步驟如下:
O菌種篩選:從瓊脂原料中篩選瓊膠酶的微生物，經(jīng)分離，得到純種微生物，再進(jìn)行相對高產(chǎn)的菌株分離，將菌株做分子鑒定，并保存?zhèn)溆茫?br> 2)發(fā)酵:將步驟I)的菌株作為初始菌落，按菌落起始工作體積的5%接種，再做二次菌株培養(yǎng)，并根據(jù)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行控制，根據(jù)菌體的生長情況和酶的產(chǎn)量，確定發(fā)酵工藝；
3)純化工藝:在確定的發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，首先進(jìn)行鹽析進(jìn)行粗純，而后通過層析柱進(jìn)行精純，獲得滿足臨床診斷需求的精制酶。
[0007]優(yōu)選地，所述的步驟2)中相關(guān)參數(shù)的控制為:①溶氧及轉(zhuǎn)速:空氣流速0.5-lvvm,最低攪拌轉(zhuǎn)速為200-400 r/min,分批階段控制溶解氧在40 %，補(bǔ)料階段設(shè)定在20 %，發(fā)酵罐提高或降低轉(zhuǎn)速自動(dòng)控制；(DpH值:自動(dòng)流加25%的氨水和50%磷酸，使pH值保持在7.0 ;③溫度:28°C，自動(dòng)控制。
[0008]優(yōu)選地，所述的步驟3)純化工藝的具體操作為:首先將發(fā)酵液通過硫酸銨沉淀粗純，將酶液的體積濃縮10?20倍，以便于粗酶液的保存；在精純過程中，將粗酶液分成若干份，控制每批精制酶的純化規(guī)模。
[0009]優(yōu)選地，將最終制成的精制酶進(jìn)行外觀、純度以及效價(jià)的檢測評估。
[0010]優(yōu)選地，所述的步驟2)中發(fā)酵的方式為補(bǔ)料分批發(fā)酵。
[0011]本發(fā)明提供了一種高純度瓊膠酶的制備工藝，篩選分離獲得瓊膠酶的產(chǎn)生菌，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化、親和層析介質(zhì)純化分離和穩(wěn)定化技術(shù)，高效制備高純度瓊膠酶產(chǎn)品。工藝可放大至生產(chǎn)規(guī)模，有望實(shí)現(xiàn)瓊膠酶的產(chǎn)業(yè)化，填補(bǔ)國內(nèi)空白。利用制備的高純度瓊膠酶，采用可控酶解技術(shù)，制備瓊脂低聚糖產(chǎn)品，拓寬瓊脂在食品工業(yè)中的應(yīng)用。瓊脂低聚糖產(chǎn)品可填補(bǔ)國內(nèi)空白。
【具體實(shí)施方式】
[0012]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013]本實(shí)施例提供一種高純度瓊膠酶的制備工藝，制備工藝步驟如下:
O菌種篩選:從瓊脂原料中篩選瓊膠酶的微生物，經(jīng)分離，得到純種微生物，篩選以瓊脂為唯一碳源，再進(jìn)行相對高產(chǎn)的菌株分離，將菌株做分子鑒定，并保存?zhèn)溆茫?br> 2)發(fā)酵:將步驟I)的菌株作為初始菌落，按菌落起始工作體積的5%接種，再做二次菌株培養(yǎng)，并根據(jù)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行控制，根據(jù)菌體的生長情況和酶的產(chǎn)量，確定發(fā)酵工藝；在穩(wěn)定、可控的大規(guī)模培養(yǎng)過程中實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)目標(biāo)。發(fā)酵的方式為補(bǔ)料分批發(fā)酵；
3)純化工藝:在確定的發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，首先進(jìn)行鹽析進(jìn)行粗純，而后通過層析柱進(jìn)行精純，獲得滿足臨床診斷需求的精制酶。
[0014]步驟2)中相關(guān)參數(shù)的控制為:①溶氧及轉(zhuǎn)速:空氣流速0.5-lvvm,最低攪拌轉(zhuǎn)速為200-400 r/min，分批階段控制溶解氧在40%，補(bǔ)料階段設(shè)定在20%，發(fā)酵罐提高或降低轉(zhuǎn)速自動(dòng)控制?’②PH值:自動(dòng)流加25%的氨水和50%磷酸，使pH值保持在7.0 ;③溫度:28 °C，自動(dòng)控制。
[0015]酶最易在純化階段失活，因此純化環(huán)節(jié)將是生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本控制的最為核心的步驟。步驟3)純化工藝的具體操作為:首先將發(fā)酵液通過硫酸銨沉淀粗純，將酶液的體積濃縮10?20倍，以便于粗酶液的保存；在精純過程中，將粗酶液分成若干份，控制每批精制酶的純化規(guī)模。根據(jù)已經(jīng)完成的前期酶的精制工作，后繼的純化工藝研究主要包括:純化體系的放大、純化效率提高和純化成本的降低。
[0016]將最終制成的精制酶進(jìn)彳丁外觀、純度以及效價(jià)的檢測評估。
[0017]步驟2)中發(fā)酵的方式為補(bǔ)料分批發(fā)酵。大大節(jié)約了在制備發(fā)酵過程中的成本，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用。
[0018]以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高純度瓊膠酶的制備工藝，其特征在于，制備工藝步驟如下: 1)菌種篩選:從瓊脂原料中篩選瓊膠酶的微生物，經(jīng)分離，得到純種微生物，再進(jìn)行相對高產(chǎn)的菌株分離，將菌株做分子鑒定，并保存?zhèn)溆茫? 2)發(fā)酵:將步驟1)的菌株作為初始菌落，按菌落起始工作體積的5%接種，再做二次菌株培養(yǎng)，并根據(jù)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行控制，根據(jù)菌體的生長情況和酶的產(chǎn)量，確定發(fā)酵工藝； 3)純化工藝:在確定的發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，首先進(jìn)行鹽析進(jìn)行粗純，而后通過層析柱進(jìn)行精純，獲得滿足臨床診斷需求的精制酶。2.如權(quán)利要求1所述的高純度瓊膠酶的制備工藝，其特征在于，所述的步驟2)中相關(guān)參數(shù)的控制為:①溶氧及轉(zhuǎn)速:空氣流速0.5-lvvm,最低攪拌轉(zhuǎn)速為200-400 r/min,分批階段控制溶解氧在40%，補(bǔ)料階段設(shè)定在20%，發(fā)酵罐提高或降低轉(zhuǎn)速自動(dòng)控制值:自動(dòng)流加25%的氨水和50%磷酸，使pH值保持在7.0 ;③溫度:28°C，自動(dòng)控制。3.如權(quán)利要求1所述的高純度瓊膠酶的制備工藝，其特征在于，所述的步驟3)純化工藝的具體操作為:首先將發(fā)酵液通過硫酸銨沉淀粗純，將酶液的體積濃縮10?20倍，以便于粗酶液的保存；在精純過程中，將粗酶液分成若干份，控制每批精制酶的純化規(guī)模。4.如權(quán)利要求1所述的高純度瓊膠酶的制備工藝，其特征在于，將最終制成的精制酶進(jìn)行外觀、純度以及效價(jià)的檢測評估。5.如權(quán)利要求1所述的高純度瓊膠酶的制備工藝，其特征在于，所述的步驟2)中發(fā)酵的方式為補(bǔ)料分批發(fā)酵。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高純度瓊膠酶的制備工藝，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。通過1）菌種篩選：從瓊脂原料中篩選瓊膠酶的微生物，經(jīng)分離，得到純種微生物，再進(jìn)行相對高產(chǎn)的菌株分離，將菌株做分子鑒定，并保存?zhèn)溆茫?）發(fā)酵：將步驟1）的菌株作為初始菌落，按菌落起始工作體積的5％接種，再做二次菌株培養(yǎng)，并根據(jù)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行控制，根據(jù)菌體的生長情況和酶的產(chǎn)量，確定發(fā)酵工藝；3）純化工藝：首先進(jìn)行鹽析進(jìn)行粗純，而后通過層析柱進(jìn)行精純。整個(gè)制備工藝使得篩選分離獲得瓊膠酶的產(chǎn)生菌，經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化、親和層析介質(zhì)純化分離和穩(wěn)定化技術(shù)，高效制備高純度瓊膠酶產(chǎn)品。可進(jìn)一步推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12N9/24, C12N9/42
【公開號】CN105331597
【申請?zhí)枴緾N201510759047
【發(fā)明人】陳振祥
【申請人】福建省金燕海洋生物科技股份有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月10日