的水型nadh氧化酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的NADH氧化酶，具體是一種可再生輔酶NAD+的水型 NADH氧化酶及其編碼基因與應(yīng)用，該氧化酶能夠利用〇2作為底物將NADH氧化為NAD%同時(shí) 生成副產(chǎn)物&0。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著氧化還原酶在生物催化制備手性醇、手性徑酬、徑基酸、氨基酸等方面顯示越 來越重要的作用，在制藥，食品，精細(xì)化工，農(nóng)藥等領(lǐng)域均表現(xiàn)出廣泛的用途，對該類型的酶 的研究也成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一。但是氧化還原酶在反應(yīng)過程中，需要消耗一定量輔酶， 大約80 %的氧化還原酶的輔酶為尼克酷胺腺嚷嶺二核巧酸（NAD7NADH)，使得運(yùn)類輔酶在 工業(yè)和科研上的需求隨之劇增。然而，輔酶的價(jià)格是非常昂貴的，有時(shí)甚至比酶催化反應(yīng)所 得到的產(chǎn)物的價(jià)格還要高，而其重復(fù)利用性和穩(wěn)定性卻很低。輔酶再生是實(shí)現(xiàn)氧化還原酶 催化反應(yīng)的必需步驟，是關(guān)系到氧化還原酶工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。而對于很多氧化還原酶的 應(yīng)用來講，輔酶再生面臨巨大的挑戰(zhàn)。
[0003] 輔酶再生的方法主要有生物法、酶法、化學(xué)法、電化學(xué)法和光化學(xué)法。酶法原位再 生輔酶由于操作簡單、效率高專一性強(qiáng)，而且可與其它酶兼容，受到人們的青睞。酶法再 生輔酶的方法中，應(yīng)用于還原性輔酶（NAD(巧H)的再生已經(jīng)比較成熟，如甲酸脫氨酶再生 NADH和葡萄糖脫氨酶再生NADPH。而氧化性輔酶（NAD任η的再生方法卻很少，實(shí)現(xiàn)氧化 性輔酶的再生，對于在生物催化過程中生產(chǎn)難W制備的酬類化合物或?qū)?yīng)體純的醇類化合 物是非常關(guān)鍵的。目前應(yīng)用比較多的方法主要有：醇脫氨酶還原丙酬生成異丙醇再生輔酶 NAD+;乳酸脫氨酶還原丙酬酸生成乳酸再生輔酶NAD谷氨酸脫氨酶還原α-酬戊二酸生成 谷氨酸使NAD+再生。但是運(yùn)些方法仍然還難W滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，因?yàn)檫\(yùn)些方法通常 需要加入輔底物，并有輔產(chǎn)物生成，使下游提取過程更加困難，生產(chǎn)成本也大大增加，有時(shí) 甚至?xí)a(chǎn)生酶抑制現(xiàn)象影響反應(yīng)效率。
[0004] 最近幾年，通過NADH氧化酶再生輔酶逐漸得到了人們的重視，NADH氧化酶（NADH oxidase,Ν0Χ，EC1. 6. 99. 3)是一種黃素蛋白，在〇2存在條件下，該酶催化NADH氧化為NAD+ 的同時(shí)〇2還原為H2O或&〇2。根據(jù)〇2還原后產(chǎn)物的不同，N0X可分為兩類：一類還原為H2O2， 反應(yīng)過程產(chǎn)生2個(gè)電子的轉(zhuǎn)移，稱之為&〇2型NADH氧化酶；另一類還原為Η2〇,反應(yīng)過程中 產(chǎn)生4個(gè)電子的轉(zhuǎn)移，稱之為&0型NADH氧化酶。&〇2型NADH氧化酶，由于產(chǎn)生的過氧化 氨對氧化還原酶有失活作用，而且在應(yīng)用過程中需要加入過氧化氨酶分解電〇2,運(yùn)樣使得反 應(yīng)體系更加復(fù)雜，因此在應(yīng)用上該型酶受到一定限制。鑒于W上原因，電0型NADH氧化酶 的研究越來越受到人們的重視，因?yàn)樗漠a(chǎn)物為水，對反應(yīng)體系基本沒有多大影響，操作簡 單且容易分離，可用于再生NAD+，具有廣闊的應(yīng)用前景，是非常有潛力的氧化態(tài)輔酶再生體 系之一。目前，國外已有不少關(guān)于不同來源的N0X的研究報(bào)道，但是能應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的 &0型NADH氧化酶還是比較少，所W挖掘開發(fā)更多新型高活性&0型NADH氧化酶是非常有 必要的，目前國內(nèi)專口針對該類型酶的研究還比較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種可再生輔酶NAD+的水型NADH氧化酶及其編碼基因與應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：可再生輔酶NAD+的水型NADH氧化酶，是如 SEQIDNO. 1所示的氨基酸序列。
[0007] 上述水型NADH氧化酶的制備步驟為：
[0008]S1:將如沈QIDNO. 2所示的水型NADH氧化酶編碼基因插入到質(zhì)粒中得到重組表 達(dá)載體；
[0009]S2:將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主微生物中得到基因工程菌；
[0010]S3:培養(yǎng)所述基因工程菌得到重組NADH氧化酶，即本發(fā)明所述水型NADH氧化酶。
[0011] 上述水型NADH氧化酶來源于戊糖乳桿菌LactobacilluspentosusATCC8041。 所述水型NADH氧化酶具有如下酶學(xué)性質(zhì)：(a)利用化作為底物，將NADH氧化為NAD%同時(shí) 生成副產(chǎn)物&0;化）最佳抑為5. 0~10. 0、最佳溫度為10~50°C情況下酶活最高；（C)通 過SDS-PAGE測定的分子量為45-55kDa;(d)酶活最大為124U/mg，Km為99μM，kcat/km為 62.6min1μΜ1; (e)與短乳桿菌L.breviDSM20054中獲得的化Nox具有的64%氨基酸序 列同源性。
[0012] 另外，本發(fā)明提供了可再生輔酶NAD+的水型NADH氧化酶在甘油轉(zhuǎn)化生成1，3-二 徑基丙酬中的應(yīng)用。
[0013] 針對該應(yīng)用，所述甘油轉(zhuǎn)化生成1,3-二徑基丙酬的方法為：在水型NADH氧化酶、 甘油脫氨酶及輔酶存在下，底物甘油發(fā)生氧化反應(yīng)生成1，3-二徑基丙酬。其轉(zhuǎn)化生成路線 如下：
[00141
[001引式中：glycerol指甘油；GlyDH指甘油脫氨酶；LpNox指水型NA畑氧化酶； 1, 3-dihy化oxyacetone指 1, 3-二徑基丙酬值HA)。
[0016] 優(yōu)選的，該方法是在抑為5. 0~10. 0的憐酸緩沖液中實(shí)現(xiàn)的；另外，所述的輔酶 為NADH及NAD+中的一種或兩種W任意比例混合的混合物。還有，該方法的反應(yīng)溫度為10~ 50 °C。
[0017] 具體應(yīng)用時(shí)，所述水型NADH氧化酶在反應(yīng)體系中的用量為l-20U/mL。所述輔酶的 加入量在反應(yīng)體系中的用量為0. 002-2.OmM。
[0018] 采用本發(fā)明所述水型NADH氧化酶，可W利用該酶與甘油脫氨酶體外串聯(lián)轉(zhuǎn)化甘 油生成1，3-二徑基丙酬，與化學(xué)方法制備1，3-二徑基丙酬相比，該方法具有反應(yīng)條件溫 和，對環(huán)境友好，操作簡單，易于放大等優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0019] 圖1為LpNox經(jīng)蛋白純化后聚丙締酷胺凝膠電泳結(jié)果。
[0020] 圖2為LpNox最佳抑研究結(jié)果示意圖。
[0021] 圖3為LpNox最適催化溫度的研究結(jié)果示意圖。
[0022] 圖4為LpNox溫度穩(wěn)定性的研究結(jié)果示意圖。
[0023] 圖5為LpNox與甘油脫氨酶體外串聯(lián)轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-二徑基丙酬的時(shí)間進(jìn)程 示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖，給出本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并予W詳細(xì)描述。
[00巧]SanPr巧柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（SK8141)購于生工生物工程（上海）股份有 限公司。SanPr巧柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（SK8192)購于生工生物工程（上海）股 份有限公司；PCR擴(kuò)增試劑dNTP，Buffer,Taq酶購于生工生物工程（上海）股份有限公司； 限制性內(nèi)切酶BamHiahoI購于Takara;連接酶和ligationbuffer購于SCIENTIFIC;PCR 引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司；DM上樣緩沖液，DM標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker購 于生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白雙染色Marker購于生工生物工程（上海）股 份有限公司。
[0026] 下列實(shí)施中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0027] 1.在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的大腸桿菌培養(yǎng)基配制方法如下：
[0028] (1)LB培養(yǎng)基
[002引1L的LB液體培養(yǎng)基中加入10.Og化C1，10.Og膜蛋白腺，5.Og酵母浸粉，定容到1L后，用抑計(jì)檢測其抑，一般顯堿性，然后用5mol/L的化0H慢慢調(diào)節(jié)抑至7.0。若是配 置固體培養(yǎng)基，可在配好的液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，按1. 5%的含量加入瓊脂粉。密封好后，用 高壓蒸汽滅菌鍋在12rC下，滅菌30min，待冷卻后放在4°C低溫冰箱中保存待用。
[0030] 似TB培養(yǎng)基
[0031] 將下列組分溶解在0.化水中：膜蛋白腺12g，酵母提取物24g，甘油4mL。將各組 分溶解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加入lOOmL滅過菌的憐酸緩沖液（2. 31g的KH2PO4和 12. 54g的K2HPO4溶于100血水中。）。
[0032] 2. 1，3-二徑基丙酬含量的檢測方法：
[0033] 取反應(yīng)液液50μL加水稀釋至500μL取稀釋液離屯、后的上清液50μL加入二 苯胺溶液450μL，沸水浴加熱14min，流水冷卻。W二苯胺溶液為空白，于608皿處測吸光 度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液中產(chǎn)物1，3-二徑基丙酬的含量。
[0034] 實(shí)驗(yàn)例1NADH氧化酶基因的篩選和分析
[0035] 通過對NCBI基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選和分析，確定在戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosusATCC8041基因組中與短乳桿菌NADH氧化酶具有較高同源性的蛋白基因序列為 候選研究對象，基因序列SEQIDNO. 2所示。
[0036] 實(shí)驗(yàn)例2重組表達(dá)載體祀T28a-LpNox和祀T28a-GlyDH構(gòu)建
[0037] 根據(jù)基因序列（LpNox基因及GlyDH基因）設(shè)計(jì)引物，LpNox基因上游引物為CG CGGATCCATGAAAGTTATCGTAATTGGTTGTACTCAT,下游引物為CCGCTCGAGTTATTCCGTCACTTTTTC AGCCGC;GlyDH基因上游引物為CGCGGATCCATGGACCGCATTATTCAATCACCGG，下游引物為 CCGCTCGAGTTATTCCCACTCTTGCAGGAAACGC，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合 成。下劃線部分為BamHI和化〇1酶切位點(diǎn)。再W戊糖乳桿菌基因組和大腸桿菌基因組為模 板PCR擴(kuò)增得到LpNox基因和GlyDH基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明擴(kuò)增得到的基因大小 與理論值一致。將回收的LpNox基因，GlyDH基因和祀T28a，用限制性內(nèi)切酶BamHI和化〇1 在37°C水浴中酶切2小時(shí)，經(jīng)純化回收的目的片段與質(zhì)粒在T4連接酶的作用下室溫過夜連 接，得到重組表達(dá)載體祀T28a-LpNox和祀T28a-GlyDH。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21 (DE3)的感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡納抗性的平