一種半滑舌鰨性染色體連鎖的dna片段及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)中的魚類遺傳性別鑒定和性別控制技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及 一種半滑舌錦性染色體連鎖的DNA片段及其在快速鑒定半滑舌錦遺傳性別中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引半滑舌錦（切noglossussemilaevis)俗稱"錦米，，、"錦目"，屬于蝶形目、舌錦科、 舌錦屬，是一種近海溫水大型底棲魚類，在我國(guó)從勸海到南海都有分布，其中W勸海最多， 黃海次之（柳學(xué)周等2005 ;孟慶聞等1995)。半滑舌錦肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，日漸為 人們所喜；且營(yíng)養(yǎng)級(jí)低、食性溫和，活動(dòng)范圍小、便于工廠化養(yǎng)殖和管理，具有廣闊的養(yǎng)殖前 景，近年來已成為我國(guó)北方沿海地區(qū)一種優(yōu)良的增養(yǎng)殖對(duì)象（柳學(xué)周等2005)。
[0003] 半滑舌錦具有20對(duì)常染色體和一對(duì)性染色體狂和W染色體），其性別決定機(jī)制 為ZW型，遺傳雌魚為異型染色體ZW，遺傳雄魚為同型染色體ZZ(周麗青等，2005)。在自然 條件下，雄性半滑舌錦產(chǎn)生Z型精子，雌性半滑舌錦產(chǎn)生Z、W型兩種卵子，受精后得到正常 的ZZ雄性和ZW雌性后代。在養(yǎng)殖過程中，半滑舌錦雌性個(gè)體生長(zhǎng)速度明顯大于雄性，研究 發(fā)現(xiàn)在21月齡時(shí)雌性個(gè)體重量可W達(dá)到雄性個(gè)體的3. 29倍（陳松林等2013)。在自然養(yǎng) 殖條件下有些遺傳雌性半滑舌錦表現(xiàn)為生理雄性，稱為偽雄魚，研究表明偽雄魚的后代中 偽雄魚個(gè)體比例更高（Shaoetal.，2014 ;季相山等2010)。養(yǎng)殖群體中高比例的生理雄性 (正常雄魚和偽雄魚）會(huì)降低半滑舌錦產(chǎn)量，因此，在半滑舌錦親魚的選育過程中需要剔除 偽雄魚。開發(fā)半滑舌錦性別特異分子標(biāo)記，建立快速鑒定遺傳性別的方法，是進(jìn)行半滑舌錦 性別控制和提高養(yǎng)殖群體中雌性比例的有效途徑，對(duì)實(shí)現(xiàn)半滑舌錦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展有 重要意義。
[0004] 在半滑舌錦性別特異分子標(biāo)記的開發(fā)和遺傳性別鑒定方面，黃海水產(chǎn)研究所已經(jīng) 先后篩選到半滑舌錦雌性特異的AFLP標(biāo)記（化enetal. ,2007)和性別特異的微衛(wèi)星標(biāo)記 (化enetal.，2012)。但是在實(shí)際應(yīng)用中，運(yùn)兩種標(biāo)記都有自身的不足。AFLP標(biāo)記由于其 顯性的遺傳特性，在實(shí)際鑒定中有可能會(huì)出現(xiàn)假陰性，從而對(duì)ZZ雄性和ZW雌性產(chǎn)生誤判。 共顯性的微衛(wèi)星性別特異標(biāo)記雖然可W準(zhǔn)確鑒定ZZ雄性和ZW雌性個(gè)體，但由于其兩條DNA 片段條帶之間僅有12bp的差異，無法用瓊脂糖凝膠電泳分辨，只能通過分辨力更高的聚丙 締酷胺凝膠（PAGE膠）電泳的方法進(jìn)行鑒別，而PAGE膠電泳的操作難度大、操作時(shí)間長(zhǎng)、對(duì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑等要求高，增加了遺傳性別鑒定的時(shí)間、提高了成本，難W在半滑舌錦養(yǎng)殖 場(chǎng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，半滑舌錦性別控制研究和高雌性苗種生產(chǎn)還需要一種能采用瓊脂 糖凝膠電泳方法準(zhǔn)確分辨、且可W在養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的遺傳性別快速鑒定的分子技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽(yáng)0化]本發(fā)明提供了一種半滑舌錦性染色體連鎖的DNA片段及其應(yīng)用，即一種半滑舌錦 性染色體連鎖的DNA片段并應(yīng)用到半滑舌錦遺傳性別鑒定W及偽雄魚篩選中。
[0006] 本發(fā)明首先通過生物信息學(xué)方法分析半滑舌錦全基因組序列，提供了兩條半滑舌 錦Z、W染色體同源差異DM片段，其中Z染色體上DM片段長(zhǎng)36化p，命名為SE化虹Z，其序 列為：
[0008] W染色體上DNA片段長(zhǎng)度為253bp，命名為沈化虹W，其序列為：
[0010] 上述的DNA片段用于設(shè)計(jì)鑒定半滑舌錦遺傳性別的分子標(biāo)記；
[0011] 本發(fā)明還基于運(yùn)兩條DNA片段序列設(shè)計(jì)了一對(duì)性染色體連鎖的DNA片段引物，可 W通過普通濃度（1.5%)的瓊脂糖凝膠電泳清晰分Z、W染色體特異DNA片段，準(zhǔn)確鑒定半 滑舌錦遺傳性別，上、下游引物序列分別為：
[0012] SEQZW:1 :5' -GTCACAGTTCCAACCAGGACAAGAG-3'(沈Q ID N0:3);
[0013]沈Q ZW:2:5' -CCTGTTGTTGTTCTACTAAGTCTG-3'(沈Q ID N0:4);
[0014] 使用上述的引物來鑒定半滑舌錦遺傳性別，主要包括W下步驟：
[0015] 半滑舌錦基因組DNA的提取、Z、W同源差異DNA片段PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)步驟；其中在遺傳雄性個(gè)體中擴(kuò)增出36化P的單一DNA片段；在遺傳雌性個(gè)體 中擴(kuò)增出366bp和253bp的兩種DNA片段。
[0016] 本發(fā)明從半滑舌錦全基因組信息中篩選到兩條Z、W染色體同源差異DNA片段，設(shè) 計(jì)引物進(jìn)行半滑舌錦遺傳性別鑒定，可W快速、準(zhǔn)確、有效的區(qū)分半滑舌錦遺傳性別。該方 法在雌、雄個(gè)體中都可擴(kuò)增出特異目的條帶并可W用瓊脂糖電泳分辨，縮短了準(zhǔn)確鑒定半 滑舌錦遺傳性別的時(shí)間，適用于養(yǎng)殖場(chǎng)簡(jiǎn)易環(huán)境內(nèi)半滑舌錦遺傳性別的鑒定，節(jié)約了檢測(cè) 時(shí)間和成本。本發(fā)明所示檢測(cè)半滑舌錦遺傳性別的方法，可用于對(duì)偽雄魚的鑒定和篩選，對(duì) 提高養(yǎng)殖群體雌性比例，推動(dòng)半滑舌錦養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1 :本發(fā)明Z、W染色體DNA片段序列比對(duì)圖，引物位置用下劃線表示誼格：Z、W 染色體DM片段差異序列；* :Z、W染色體DM片段一致序列；-:缺失序列
[001引圖2:本發(fā)明遺傳雌、雄半滑舌錦PCR產(chǎn)物1. 5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，畢：遺傳 雌魚；?:遺傳雄魚；Μ :DL 2000DNA Maker;
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0020] 實(shí)施例1半滑舌錦性染色體連鎖DNA片段的篩選
[0021] 本發(fā)明所用的性染色體連鎖的DM片段序列來源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水 產(chǎn)研究所水產(chǎn)基因組與細(xì)胞工程研究室完成的半滑舌錦全基因組測(cè)序結(jié)果，生物信息學(xué)分 析半滑舌錦基因組序列篩選出兩條Z、W染色體同源差異DNA片段。設(shè)計(jì)多對(duì)引物，篩選出 了結(jié)果穩(wěn)定的一對(duì)引物（SEQZW:1、SEQZW:2)。 陽(yáng)02引選擇已知遺傳性別的雌、雄半滑舌錦DNA，使用引物SEQZW: 1、SEQZW:2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件及程序如下：PCR反應(yīng)體系包括35. 5μLd地20點(diǎn)0μL10XBuffer;4. 0μL dNTP(2. 5mmol/L) ;1.0μΙ沈QZW:l(10