西瓜InDel分子標(biāo)記及其開發(fā)方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子標(biāo)記技術(shù)，具體設(shè)及西瓜InDel分子標(biāo)記及其開發(fā)方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 西瓜為葫蘆科作物，是世界上熱帶和亞熱帶的一種重要經(jīng)濟(jì)蔬菜作物。西瓜含有 許多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括巧、鐵、鐘和維生素（VA和VC)。由于西瓜味甜多汁深受消費(fèi)者的喜 愛。2013年全球西瓜種植面積為349萬(wàn)公頃，產(chǎn)量達(dá)到了 1.09億噸。
[0003] 分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于蔬菜作物的研究，如品種鑒定、遺傳多樣性分析、進(jìn)化分 析、連鎖圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、數(shù)量性狀位點(diǎn)構(gòu)圖、分子輔助育種選擇等。有許多的分子 標(biāo)記被開發(fā)用于基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (AFL巧和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD)。RFLP需要放射性化學(xué)物質(zhì)的參與，RATO重復(fù)性較差，運(yùn) 些缺點(diǎn)限制了標(biāo)記在育種計(jì)劃中的應(yīng)用。與運(yùn)些早期的分子標(biāo)記相比，基于PCR的簡(jiǎn)單重 復(fù)序列（SSR)標(biāo)記相對(duì)比較簡(jiǎn)單、便宜、重復(fù)性較好，但是有些擴(kuò)增條帶不清楚及技術(shù)上的 缺陷，如假等位基因、無(wú)效等位基因?qū)е耂SR在基因型分型和數(shù)據(jù)分析上產(chǎn)生錯(cuò)誤。
[0004] 近年來(lái)，基因組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，尤其Illumina公司的第二代邊合成邊測(cè)序 技術(shù)的出現(xiàn)，使得動(dòng)植物在基因組測(cè)序、重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組分析、sRNA和表觀基因組研究等方 面有了很大的進(jìn)展。高通量測(cè)序技術(shù)為SSR、SNP和InDel標(biāo)記的開發(fā)提供了可能。SNP是 一種高通量、低成本的新型分子標(biāo)記，為分子輔助育種提供了一種可選擇的方法，但是它受 限于基因型分型技術(shù)，雖然有許多的基因型分型技術(shù)可獲得，但是運(yùn)些技術(shù)在小型和中型 檢測(cè)中成本高，操作復(fù)雜，且需要特殊的設(shè)備。 陽(yáng)0化]InDel標(biāo)記是指由核巧酸水平上堿基的插入或缺失多態(tài)性，在植物基因組中有較 高的分布頻率，具有遺傳穩(wěn)定性高、分布廣、多態(tài)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。較之SSR標(biāo)記，InDel分布密 度遠(yuǎn)高于SSRs。較之SNP標(biāo)記，InDel呈現(xiàn)共顯性，PCR極易檢測(cè)，使用成本極低。目前，隨 著基因組學(xué)及生物信息學(xué)的的發(fā)展，大量公共數(shù)據(jù)如表達(dá)序列標(biāo)簽巧ST)、cDNA和基因組 序列等信息大量出現(xiàn)，使得通過(guò)生物信息學(xué)方法可得到候選InDel成為可能。目前已在水 稻、玉米、黃瓜、白菜等主要作物中得到廣泛應(yīng)用?；诟咄繙y(cè)序數(shù)據(jù)技術(shù)開發(fā)WPCR為 基礎(chǔ)、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用價(jià)值大的InDel標(biāo)記，可為控制西瓜重要農(nóng)藝性狀基因的定位、遺傳 多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、全基因組關(guān)聯(lián)分析與高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記 輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于開發(fā)西瓜InDel分子標(biāo)記，提供多態(tài)性引物，建 立西瓜InDel標(biāo)記開發(fā)的技術(shù)體系，為西瓜的遺傳背景分析提供更多新的InDel標(biāo)記，彌補(bǔ) 目前西瓜InDel標(biāo)記較為缺乏的不足。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一組西瓜InDel分子標(biāo)記，其特征 在于：所述InDel分子標(biāo)記包括有如下54個(gè)位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的正向和反向引物：
[0008]
[0009]
[0010]本發(fā)明所述的西瓜InDel分子標(biāo)記的開發(fā)方法，包括W下步驟： 陽(yáng)0川 1)對(duì)西瓜抗病自交系JRwOS-3的基因組DNA進(jìn)行提取； 陽(yáng)〇1引。構(gòu)建DNA文庫(kù)，利用Illumina Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行陽(yáng)150模式重測(cè)序；利用生 物信息學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行清理、組裝成Contigs ;通過(guò)大規(guī)模同源比對(duì)進(jìn)行InDel位點(diǎn)的篩 選；利用R語(yǔ)言結(jié)合Primer3. 0引物設(shè)計(jì)軟件，大規(guī)模設(shè)計(jì)InDel標(biāo)記引物；
[0013] 3)利用InDel引物對(duì)西瓜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳及非變性聚 丙締酷胺凝膠電泳檢測(cè)。
[0014] 進(jìn)一步的，在所述步驟3)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20ul，其中含2μ1基因組 DNA(200ng/yl)，2yl10XPCRbuffer(2.OmMMgCl2)，2. 0μ1dNTPs(2. 5πιΜ)，1.0μ1正向 引物（10μΜ)，1.0μ1反向引物（10μΜ)，0. 5μ1 2. 5Units/ylTaqDNA聚合酶燈AKARA)， 11. 5μ1 (1地2〇。 陽(yáng)01引進(jìn)一步的，在所述步驟3)中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C5min;94°C40S，55°C30S， 72°C45S，36 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin。
[0016] 進(jìn)一步的，在所述步驟3)中瓊脂糖凝膠電泳電壓條件為120V恒壓，電泳時(shí)間為 0.化~比；非變性聚丙締酷胺凝膠電壓條件為預(yù)電泳50V~60V30min，120V電泳化~ 2.2h〇
[0017] 進(jìn)一步的，該方法可應(yīng)用于包括黃瓜、冬瓜、南瓜、絲瓜在內(nèi)的所有葫蘆科作物 InDel分子標(biāo)記的開發(fā)。
[0018] 本發(fā)明所述的西瓜InDel分子標(biāo)記在西瓜遺傳圖譜構(gòu)建、Q化定位、分子輔助育種 及遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明利用Illumina重測(cè)序技術(shù)對(duì)西瓜抗性父本材料的基因組進(jìn)行了測(cè)序。在 15461個(gè)contigs鑒定得到了 25701個(gè)潛在的InDel標(biāo)記，合成了 69對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增 篩選發(fā)現(xiàn)了 54對(duì)多態(tài)性引物。通過(guò)發(fā)掘西瓜Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)，開發(fā)了新型多態(tài)性InDel 標(biāo)記，對(duì)西瓜的抗性育種具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為54個(gè)InDel標(biāo)記瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果。
[0021] 1 ~54 分別為InDelOl、InDel03、InDel04、InDel07、InDelOS、InDelOg、InDellO、 InDelll、InDell3、InDell4、InDell7、InDellS、InDelig、InDel20、InDel21、InDel22、 InDel23、InDel24、InDel26、InDel28、InDel29、InDel30、InDel31、InDel32、InDel33、 InDel34、InDel35、InDel36、InDel37、InDel38、InDel39、InDel40、InDel41、InDel42、 InDel43、InDel44、InDel45、InDel46、InDel47、InDelSO、InDelSl、InDel52、InDel53、 InDel54、InDel55、InDel57、InDel58、InDel60、InDel63、InDel64、InDel65、InDel67、 InDel68、InDel69,前一泳道為母本JSwOl-1，后一泳道為父本JRw08-3,M為用于糾正實(shí)驗(yàn) 偏差的標(biāo)準(zhǔn)分子量。
【具體實(shí)施方式】
[0022] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0023]所用DNAMaker為TaKaRa公司生產(chǎn)的DL2000,由DNA片段 2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、lOObp組成，共6條帶。
[0024] 1、西瓜DNA的提取
[00巧]參考Liu,L.W. ,W.Z.加0,X.F.Zhu,andT.Z.Zhang.Inheritanceandfine mappingoffertilityrestorationforcytoplasmicmalesterilityinGossypium