Aiv h7n9亞型雙重微滴式數(shù)字pcr絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及試劑盒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)設(shè)及一種檢測(cè)禽流感病毒H7N9亞型 的雙重微滴式數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感病毒H7N9亞型（AIVH7N9)是一種甲型流感病毒，是禽流感病毒的一個(gè)亞 型。2013年H7N9禽流感感染人病例出來(lái)W來(lái)，中國(guó)杭州疾控中屯、和WHO中國(guó)流感中屯、共 采集、分析了 4個(gè)新H7N9甲型禽流感的基因組，并在GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)上公布。利用運(yùn)4個(gè)基 因組W及1193個(gè)已知的流感各亞型的基因組，分析全面的系統(tǒng)生成樹(shù)和進(jìn)化歷程。結(jié)果表 明，在新H7N9亞型型禽流感的8個(gè)基因中，表面血凝素化aemagglutinin，H)蛋白基因來(lái)自 于H7亞型病毒，神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase,腳基因來(lái)自韓國(guó)野鳥(niǎo)中分離的禽流感病毒 化1腳，其余6個(gè)內(nèi)核基因任82、口81、口4、^、1、1^巧都來(lái)自?xún)?cè)肥，表明新^腳甲型禽流感 是一個(gè)變異種，是由H7、H11N9、H9N2運(yùn)Ξ個(gè)病毒的基因重組產(chǎn)生的一個(gè)全新的基因。
[0003] 為了對(duì)禽流感疫情在早期就能夠有效控制，保障動(dòng)物性食品衛(wèi)生安全，建立快速、 敏感、準(zhǔn)確的禽流感H7N9病毒檢測(cè)方法是十分必要的。近年巧光PCR技術(shù)在病毒等微生物 檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，它利用PCR技術(shù)對(duì)DNA的高效擴(kuò)增并結(jié)合探針技術(shù)的高特異性 和敏感性，克服了常規(guī)血清學(xué)和普通PCR方法的不足，但是巧光PCR技術(shù)的檢測(cè)下限仍很 高，還不能檢測(cè)出微量的病毒。
[0004]數(shù)字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在 1999年就由BedVogelstein采用并 發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)，其初衷是為了能夠從臨床樣品（如尿液、淋己液、血漿、糞便等）大量的正常 體細(xì)胞中檢測(cè)出微量的突變細(xì)胞，但由于當(dāng)時(shí)能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此 還不能非常好地體現(xiàn)數(shù)字PCR的核屯、理念--"無(wú)限稀釋"(terminaldilution)。Bio-Rad 公司的QX200系統(tǒng)核屯、的微滴化技術(shù)能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0, 000個(gè)納升級(jí)的微滴，本質(zhì)上 將傳統(tǒng)定量PCR的一個(gè)test變成20, 000個(gè)test,大大提高了核酸序列檢測(cè)的靈敏度和精 準(zhǔn)度，是對(duì)"無(wú)限稀釋"運(yùn)一概念的完美演繹，其方法原理可稱(chēng)為微滴式數(shù)字化PCROroplet DigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系統(tǒng)包括兩臺(tái)儀器：微滴發(fā)生器和微滴分析儀，及其相 關(guān)的耗材。微滴發(fā)生器將每個(gè)樣品分成20,000個(gè)均勻的納升級(jí)微滴，其中每個(gè)微滴或不含 待檢核酸祀分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸祀分子。每個(gè)微滴都作為一個(gè)獨(dú)立的PCR 反應(yīng)器。隨后微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板上，開(kāi)展終點(diǎn)PCR擴(kuò)增。采用微滴分析儀（化oplet reader)逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有巧光信號(hào)的微滴判讀為1，沒(méi)有巧光信號(hào)的微滴判讀 為0,最終根據(jù)泊松分布原理W及陽(yáng)性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算給出待檢祀分子的濃度 或拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)的定量PCR相比，數(shù)字PCR的精確度和靈敏度更佳。利用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)，研究人員可W檢測(cè)稀有突變，精確測(cè)定拷貝數(shù)變異，并對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行絕對(duì)定量。癌 癥相關(guān)突變因濃度較低，往往逃過(guò)檢測(cè)。憑借QX200系統(tǒng)的高靈敏度，研究人員如今可檢測(cè) 濃度低至1/1，000,000的祀分子。 陽(yáng)0化]全世界的研究人員已利用系統(tǒng)開(kāi)展了HIV、癌癥和疾病鑒定等方面的開(kāi)創(chuàng)性研究。 利用ddPCR，加州大學(xué)的HIV研究人員能夠證明一個(gè)出生時(shí)攜帶HIV的嬰兒已被功能性治 愈。目前，還沒(méi)有將ddPCR應(yīng)用于禽流感病毒絕對(duì)定量檢測(cè)的報(bào)道，雖然ddPCR有望用于癌 癥篩查、傳染病的診斷、食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量W及水質(zhì)監(jiān)測(cè)，但由于目前禽流感病毒容 易發(fā)生變異，特別是我國(guó)2013年發(fā)生的人感染禽流感病毒H7N9亞型就是一個(gè)新的變異基 因，致使對(duì)新發(fā)現(xiàn)的AIVH7N9的檢測(cè)工作滯后，無(wú)法有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)該亞型病毒的精確、準(zhǔn) 確、靈敏、高效、特異地檢測(cè)。因此，亟需一種能夠絕對(duì)定量檢測(cè)AIVH7N9的方法，W應(yīng)用于 流行病學(xué)調(diào)查、疫情監(jiān)控、口岸檢驗(yàn)檢疫W及食品衛(wèi)生保障領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)禽流感病毒H7N9亞型的特異性引物和探針組合。
[0007] 本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度和精確度的、操 作簡(jiǎn)單的檢測(cè)禽流感病毒H7N9亞型的檢測(cè)試劑盒。
[0008] 本發(fā)明提供了用于檢測(cè)禽流感病毒H7N9亞型的特異性引物組合，包括W下2對(duì)特 異性引物對(duì)和2條分別與引物對(duì)配合使用的特異探針，其核巧酸序列分別為：
[0009] HA-F：CCAGTGCATGTAGGAGATCAG
[0010] HA-R：ACTTAGTCATCTGCGGGAAAG
[0011] HA-P:肥X-CAGCATTGTCTGTGTTTGACAGGAGC-B冊(cè)3 陽(yáng)01引 NA-F:GGGAAACACTCAAACGGAAC
[0013] NA-R：TCATGGCAACTAGTACTTGACC
[0014] NA-P :FAM-CCAGCTTATCAGGGCGCGATACT-B冊(cè) 1。
[0015] 本發(fā)明提供了上述特異性引物和探針組合在制備禽流感病毒H7N9亞型檢測(cè)試劑 盒或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒或檢測(cè)試劑。
[0017] 本發(fā)明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的雙重微滴數(shù)字PCR絕對(duì)定 量檢測(cè)試劑盒。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒中，HA-P探針的5'端標(biāo)記巧光基團(tuán)肥X，3'標(biāo)記澤滅基 團(tuán)B冊(cè)3,NA-P探針5'標(biāo)記巧光基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記澤滅基團(tuán)肌Q1。
[0019] 本發(fā)明的試劑盒還包含病毒總RNA提取試劑和檢測(cè)試劑；所述檢測(cè)試劑包括無(wú) RNA酶的蒸饋水，一步法ddPCR探針?lè)A(yù)混液，探針?lè)╠dPCR微滴發(fā)生油，質(zhì)控液，陰性對(duì)照 和陽(yáng)性對(duì)照。
[0020] 所述病毒總RNA提取試劑含有TRIz化、氯仿或異戊醇、異丙醇。所述一步法ddPCR 探針?lè)A(yù)混液其900μ1的配方為：500μ1的2XOne-St巧RT-ddPCRSupermix，HA上、下 游引物分別為90μ1，ΝΑ上、下游引物分別為90μ1，HA和ΝΑ的特異探針?lè)謩e為20μ1，引 物和探針的濃度均為10μΜ。 陽(yáng)02U 所述陽(yáng)性對(duì)照為含有AIV-H7N9HA基因組的RNA和ΝΑ基因組RNA的混合液，陰性 對(duì)照為無(wú)RNA酶蒸饋水。
[0022] 本發(fā)明的試劑盒其工作原理是采用微滴式數(shù)字化PCR(ddPCR)，所述試劑盒的工作 程序?yàn)椋?br>[0023] (1)配制ddPCR反應(yīng)液；ddPCR反應(yīng)液20μ1配方為：一步法ddPCR探針?lè)A(yù)混液 18μ1，待測(cè)樣品RNA模板為2μ1 ;
[0024] (2)制備微滴，然后將微滴轉(zhuǎn)入PCR板，于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；
[00巧](3)將完成PCR擴(kuò)增的PCR板放入微滴分析儀中，檢測(cè)微滴，分析數(shù)據(jù)，顯示檢測(cè)結(jié) 果。 陽(yáng)0%] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，制備微滴的方法是采用Bio-Rad公司的QX200系統(tǒng)中 的微滴發(fā)生器，按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行微滴制備即可。
[0027] 其中，步驟似中PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄lOmin;95°C預(yù)變性lOmin;94°C 變性30sec，54-56°C退火60sec，共40個(gè)循環(huán)；98°ClOmin結(jié)束反應(yīng)；每步都設(shè)置2. 5°C/ sec的升降溫速度。
[0028] 本發(fā)明提供的試劑盒在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果的判定方法為：（1)陽(yáng)性對(duì)照：20±5個(gè)拷貝；似陰性對(duì) 照：<1個(gè)拷貝；待測(cè)樣本結(jié)果判定：（1)陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果>1個(gè)拷貝。（2)陰性：標(biāo)本檢 測(cè)結(jié)果<1拷貝。
[0030] 本發(fā)明摸索了引物和探針的濃度，找到了最適微滴式數(shù)字PCR的引物和探針的工 作濃度。摸索了PCR反應(yīng)過(guò)程中最適的升降溫速度，W提高數(shù)字PCR的擴(kuò)增效率，使本發(fā)明 方法能夠與BI0-RAD公司的QX200系統(tǒng)相結(jié)合。另外，在引物設(shè)計(jì)方面，由于微滴式數(shù)字 PCR最后分析結(jié)果對(duì)PCR的擴(kuò)增效率要求特別高，且特別靈敏，所W雙重的引物探針的設(shè)計(jì) 并非簡(jiǎn)單依靠軟件，還需要有特定的修飾。
[0031] 本發(fā)明試劑盒具有快速高效、操作簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、操作簡(jiǎn) 便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)