等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)在：
[0032] (1)高特異性：本發(fā)明根據(jù)禽流感H7N9 (AIV-H7N9)的血凝素基因（HA基因）和神 經(jīng)氨酸酶基因（NA基因）設(shè)計(jì)了 2對(duì)特異性引物和2條特異探針，其特異性極高，且非常穩(wěn) 定，形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行，進(jìn)一步確保H7N9檢出的特異性； 陽(yáng)03引 似高靈敏度：檢測(cè)濃度低至1/1，000,000的祀分子；能夠直接定量待測(cè)樣本中 H7N9的拷貝數(shù)；
[0034] 做低模板：由于檢測(cè)的靈敏度很高，可W檢測(cè)出低豐度的目的基因，所W可W降 低模板用量，稀釋模板濃度，對(duì)于一些珍貴，稀少的樣本可W有更多的研究；
[0035] (4)增加PCR抑制物的耐受：PCR抑制物在數(shù)字PCR生成微滴的時(shí)候會(huì)隨機(jī)分布在 兩萬(wàn)個(gè)微滴里，PCR抑制物只能影響少量的微滴反應(yīng)，不影響大局的擴(kuò)增效果，從此角度說(shuō) 明數(shù)字PCR系統(tǒng)可W-定程度上增加PCR抑制物的耐受。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為HA四對(duì)引物：尸131、尸11?2、尸21?1、尸21?2擴(kuò)增電泳圖，^尸21?2引物的擴(kuò)增效果 最佳。其中，泳道M為DL2000marker，泳道l-4分別為HA引物FlRl、FlR2、F2R2、F2Rl的 擴(kuò)增結(jié)果。
[0037] 圖2為臟四對(duì)引物化31、尸11?2、尸21?1、尸21?2擴(kuò)增電泳圖，^尸21?2引物的擴(kuò)增效果 最佳。其中，泳道Μ為DL2000marker，泳道1-4分別為NA引物F1R1、F1R2、F2R2、F2R1的 擴(kuò)增結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[003引 W下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0039]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。W40] 實(shí)施例1檢測(cè)禽流感H7N9亞型的特異性引物和探針的設(shè)計(jì)
[0041] 1、本發(fā)明引物、探針設(shè)計(jì)：W禽流感H7N9(AIV-H7N9)的血凝素基因（HA基因， GenBank登錄號(hào)為KP417119)為祀基因，W及W禽流感H7N9(AIV-H7N9)的神經(jīng)氨酸酶基因 (NA基因，GenBank登錄號(hào)為KR351266)為祀基因，進(jìn)行適用于ddPCR的特異性引物和的設(shè) 計(jì)。
[0042] 本實(shí)施例給出了篩選最佳引物的過(guò)程，選擇用軟件設(shè)計(jì)出的其中幾對(duì)備選引物進(jìn) 行篩選，備選引物如下，見(jiàn)表1。
[0043]表1
[0044]
[0046] 2、引物的篩選
[0047] (1)HA的引物隨機(jī)配為四對(duì)：F1R1、F1R2、F2R1、F2R2 ;NA的引物隨機(jī)配為四對(duì)： F1R1、F1R2、F2R1、F2R2。
[0048] (2)然后反轉(zhuǎn)錄PCR，PCR體系配方：2X One-st巧RT-ddPCR Supermix 10μ1，上 游引物，下游引物分別為lyl，RNase化ee地2〇3μ1，陽(yáng)性模板5μ1。PCR的擴(kuò)增程序 為50°C反轉(zhuǎn)錄lOmin;95°C預(yù)變性lOmin;94°C變性30sec，57°C退火60sec，共40個(gè)循環(huán)； 98°ClOmin結(jié)束反應(yīng)。 W例做用PCR產(chǎn)物，lOOV，30分鐘跑凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像，選擇特異性好，擴(kuò)增效 率好的引物對(duì)。據(jù)結(jié)果分析，HA選擇F2R2引物對(duì)，NA選擇F2R2引物對(duì)，擴(kuò)增結(jié)果的特異性 和擴(kuò)增效率最好。見(jiàn)圖1，圖2。
[0050] 3、探針的篩選
[0051] (1)引物探針的組合為：1、HA-F2R2P1+NA-F2R2P1 ;2、HA-F2R2P1+NA-F2R2P2 ;3、 HA-F2R2P2+NA-F2R2P1 ；4^HA-F2R2P2+NA-F2R2P2〇 I^OOW]似然后在ddPCR平臺(tái)上，ddPCR體系配方：2XOne-st巧RT-ddPCRSupermix10μ1，上游引物，下游引物分別為1μ1，探針?lè)謩e0. 5μ1，RNase化ee地2〇 3μ1，陽(yáng)性模 板2μ1，總體積20μ1 (引物和探針的濃度均為10μΜ)。然后生成微滴。 陽(yáng)05引（3)上PCR儀擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄lOmin;95°C預(yù)變性lOmin;94°C 變性30sec，55°C退火60sec，共40個(gè)循環(huán)；98°ClOmin結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀 檢測(cè)。
[0054] (4)分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇HA-F2R2P2+NA-F2R2P2引物探針組合。 陽(yáng)化日]實(shí)施例2在ddPCR平臺(tái)上檢測(cè)H7N9的PCR方法退火溫度的優(yōu)化。
[0056] 1、選擇引物探針的組合為：HA-F2R2P2+NA-F2R2P2。
[0057] 2、然后在ddPCR平臺(tái)上，ddPCR體系配方：2XOne-st巧RT-ddPCRSupermix 10μ1，上游引物，下游引物分別為1μ1，探針?lè)謩e0. 5μ1，RNase化ee地2〇 3μ1，陽(yáng)性模 板2μ1，總體積20μ1 (引物和探針的濃度均為10μΜ)。做8個(gè)復(fù)孔，然后生成微滴。
[0058] 3、上PCR儀擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄lOmin;95°C預(yù)變性lOmin;94°C變 性30sec，50~60°C(儀器自動(dòng)分布8個(gè)溫度梯度）退火60sec，共40個(gè)循環(huán)；98°ClOmin 結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢測(cè)。
[0059] 4、分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇54~56°C的退火溫度。
[0060] 實(shí)施例3引物、探針濃度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0061] 設(shè)計(jì)引物探針濃度均為10μM，組合為HA-F2R2P2+NA-F2R2P2,體系配置方法見(jiàn)表 2。
[0062]表2
[0063]
[0064]
[00化]然后在ddPCR平臺(tái)上生成微滴，轉(zhuǎn)移到96孔板內(nèi)，封侶膜。 W66] 上PCR儀擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄lOmin;95°C預(yù)變性lOmin;94°C變 性30sec，55°C退火60sec，共40個(gè)循環(huán)；98°ClOmin結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢 測(cè)。
[0067] 分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇HA-F2R2P2+NA-F2R2P2引物探針配方，選擇引物分 別為1.8μ1，探針?lè)謩e為0. 4μ1。
[0068] 實(shí)施例4 PCR擴(kuò)增升降溫速度的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0069] 1、然后在ddPCR平臺(tái)上，引物探針組合HA-F2R2P2+NA-F2R2P2(濃度為ΙΟμΜ), 用ddPCR體系配方：2Χ One-st巧RT-ddPCR SupermixlOyl，上游引物，下游引物分別為 1.8μ1，探針?lè)謩e0.4μ1，陽(yáng)性模板2μ1，總體積20μ1。每臺(tái)儀器做4個(gè)復(fù)孔。然后生成 微滴，轉(zhuǎn)移到PCR小管內(nèi)。
[0070] 2、在兩臺(tái)同樣的PCR儀平臺(tái)上擴(kuò)增，PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄lOmin;95°C預(yù) 變性lOmin;94°C變性30sec，55°C退火60sec，共40個(gè)循環(huán)；98°ClOmin結(jié)束反應(yīng)，一臺(tái)設(shè) 置升降溫速度設(shè)置為fTC/sec,另一臺(tái)上設(shè)置升降溫速度設(shè)置為2. 5Γ/sec,擴(kuò)增結(jié)束后， 把PCR小管內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到同一塊96孔板內(nèi)，封侶膜，上微滴數(shù)字PCR檢測(cè)儀檢測(cè)。
[0071] 3、分析結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，升降溫速度慢的最后檢測(cè)的微滴數(shù)比升降 溫速度快的多，擴(kuò)增效率高，升降溫速度慢的陰性微滴和陽(yáng)性微粒之間的距離分的很開(kāi)，很 容易區(qū)分，升降溫速度快的陰性微滴和陽(yáng)性微粒之間的距離分的不開(kāi)，不容易區(qū)分，故選擇 2. 5°C/sec升降溫速度。 W72]實(shí)施例5檢測(cè)H7N9的雙重ddPCR方法的建立[007引 1、雙重微滴數(shù)字PCR絕對(duì)定量檢測(cè)試劑盒的組裝
[0074] 將試劑盒分為A和B兩部分組裝。A部分為病毒總RNA萃取試劑，B部分為一步法 微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑，方便保存和運(yùn)輸。用合適的外包裝盒包裝W下試劑，貼標(biāo)簽（標(biāo)示 名稱、批號(hào)、生產(chǎn)日期、有效期等）。
[0075]A部分：（1)溶液AaRIzoL) -瓶，25mL;似溶液B(氯仿/異戊醇）一瓶，6mL;(3) 溶液C(異丙醇）一瓶，18血；
[0076]B部分：溶液D(RNase化ee地2〇)1支，1血；溶液E( -步法ddPCR探針?lè)A(yù)混液） 一支，900μL;溶液F(探針?lè)╠dPCR微滴發(fā)生油）一支，7ml;溶液G為ddPCR探針?lè)ㄙ|(zhì)控 液，3. 5ml;溶液Η(陽(yáng)性對(duì)照）一支，40μL;溶液I(陰性對(duì)照）一支，40μL;使