細(xì)胞剝離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種將使用培養(yǎng)容器培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)容器剝離的方法，特別涉及將使用包含具有撓曲性的膜的密閉體系的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)容器剝離的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、基因治療、再生醫(yī)療、免疫療法等領(lǐng)域中，要求在人工環(huán)境下高效地大量培養(yǎng)細(xì)胞和組織、微生物等，使用具有透氣性的培養(yǎng)袋，在封閉體系中自動地進(jìn)行細(xì)胞的大量培養(yǎng)。
[0003]然而，最近特別是使用具有萬能分化性的iPS細(xì)胞、或具有變?yōu)閷儆陂g充質(zhì)的細(xì)胞的分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞等的再生醫(yī)療等研究開發(fā)迅速地開展，而此種研究開發(fā)中使用的細(xì)胞的大部分是粘附培養(yǎng)系細(xì)胞。
[0004]粘附培養(yǎng)系細(xì)胞是附著于培養(yǎng)容器增殖的細(xì)胞，因此與在培養(yǎng)液內(nèi)以浮游狀態(tài)增殖的浮游培養(yǎng)系細(xì)胞不同，在培養(yǎng)后需要從培養(yǎng)容器剝離。由此，以往為了使粘附培養(yǎng)系細(xì)胞能夠進(jìn)行剝離操作，多在Petri培養(yǎng)皿等開放體系的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)。
[0005]然而，在Petri培養(yǎng)皿中進(jìn)行大量培養(yǎng)繁瑣且花費(fèi)工夫，因此今后為了更高效地大量培養(yǎng)，希望使用封閉體系的培養(yǎng)袋進(jìn)行培養(yǎng)。
[0006]另外，在粘附培養(yǎng)系細(xì)胞的培養(yǎng)中，需要僅培養(yǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞等選擇出的細(xì)胞，因此還要求從培養(yǎng)容器僅剝離所需的部分。
[0007]作為以往的細(xì)胞剝離方法，首先可以舉出借助胰蛋白酶處理的方法。該方法中，通過利用作為蛋白質(zhì)分解酶的胰蛋白酶，將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞與培養(yǎng)容器的粘附因子分解，而將細(xì)胞剝離。
[0008]S卩，如圖8所示，向加入了培養(yǎng)液2的Petri培養(yǎng)皿10中接種粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3而使之增殖后，從Petri培養(yǎng)皿10中除去培養(yǎng)液2 (1)。然后，用磷酸緩沖生理鹽水(PBS溶液)清洗培養(yǎng)液成分(2)，注入胰蛋白酶溶液(3)。通過在培養(yǎng)箱內(nèi)保持?jǐn)?shù)分鐘，而將粘附因子分解，粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3從Petri培養(yǎng)皿10紛紛剝落(4)。最后，向Petri培養(yǎng)皿10中注入培養(yǎng)液2，使胰蛋白酶失活，將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3與培養(yǎng)液2 —起回收。
[0009]根據(jù)此種胰蛋白酶處理，可以將接觸性培養(yǎng)細(xì)胞3從培養(yǎng)容器剝離。
[0010]另外，作為以往的細(xì)胞剝離方法，還有使用細(xì)胞刮棒物理地刮取細(xì)胞的方法(參照專利文獻(xiàn)1)。根據(jù)該方法，與胰蛋白酶處理相比操作簡單，如果是一定程度內(nèi)，則也可以剝離目標(biāo)范圍的細(xì)胞。
[0011]此外，在專利文獻(xiàn)2中，公開有如下的方法，S卩，利用具有探針的掃描型探針顯微鏡，對特定的細(xì)胞以預(yù)先確定的力按壓探針而施加物理的刺激，將細(xì)胞從基板上剝離。根據(jù)該方法，可以選擇性剝離細(xì)胞。
[0012]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0013]專利文獻(xiàn)1:日本實(shí)用新型第2531969號
[0014]專利文獻(xiàn)2:日本專利第4831543號

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明所要解決的問題
[0016]然而，在胰蛋白酶處理中，如果培養(yǎng)箱內(nèi)的保持時(shí)間過長，則會分解至細(xì)胞膜，會有損傷細(xì)胞的情況。另外，操作繁瑣，很難應(yīng)用于培養(yǎng)袋。此外，很難僅將一部分細(xì)胞群剝離，不能滿足希望僅剝離所需的部分的要求。
[0017]另外，專利文獻(xiàn)1中記載的使用細(xì)胞刮棒的方法適合于開口部大的開放形的培養(yǎng)容器，存在有難以適用于開口部小的培養(yǎng)袋的問題。
[0018]另外，專利文獻(xiàn)2中記載的利用具有探針的掃描型探針顯微鏡的方法由于使用探針，因此難以適用于培養(yǎng)袋，另外由于是將細(xì)胞一個(gè)個(gè)選擇性剝離，因此無法將培養(yǎng)袋中大量培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞高效地剝離。
[0019]由此，希望有能夠?qū)⑹褂门囵B(yǎng)袋培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)袋選擇性并且高效地剝離的技術(shù)。
[0020]因而，本發(fā)明人等對可以適用于培養(yǎng)袋的細(xì)胞剝離方法進(jìn)行了深入研究。由此發(fā)現(xiàn)，通過使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞所附著的培養(yǎng)袋的膜的面相面對的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞、并對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞施加壓力，就可以將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)袋的內(nèi)面剝離，從而完成了本發(fā)明。
[0021]S卩，本發(fā)明的目的在于，提供一種細(xì)胞剝離方法，其可以將使用包含具有撓曲性的膜的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞不造成損傷地從培養(yǎng)容器選擇性并且高效地剝離。
[0022]用于解決問題的方法
[0023]為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的細(xì)胞剝離方法是將附著在包含具有撓曲性的膜的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)容器剝離的細(xì)胞剝離方法，通過使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞所附著的培養(yǎng)容器的膜的面相面對的培養(yǎng)容器的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞、并對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞施加壓力，而將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)容器剝離。
[0024]發(fā)明效果
[0025]根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種細(xì)胞剝離方法，其可以將使用包含具有撓曲性的膜的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞不造成損傷地容易地從培養(yǎng)容器選擇性并且高效地剝離。
【附圖說明】
[0026]圖1是表示本發(fā)明的第一實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法的工序的圖。
[0027]圖2是表示本發(fā)明的第一實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法中的推壓構(gòu)件的例子的圖。
[0028]圖3是表示本發(fā)明的第二實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法的工序的圖。
[0029]圖4是表示本發(fā)明的第三實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法的工序的圖。
[0030]圖5是表示實(shí)施例1的結(jié)果的顯微鏡照片的圖。
[0031]圖6是表示實(shí)施例2的實(shí)施的樣子及結(jié)果的顯微鏡照片等的圖。
[0032]圖7是表示將利用以往的方法剝離并進(jìn)行繼代培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞與實(shí)施例2的結(jié)果所得的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞以相同密度接種而分別培養(yǎng)的結(jié)果的顯微鏡照片的圖。
[0033]圖8是表示以往的借助胰蛋白酶處理的細(xì)胞剝離方法的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明的細(xì)胞剝離方法是將附著于包含具有撓曲性的膜的培養(yǎng)容器培養(yǎng)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)容器剝離的細(xì)胞剝離方法，通過使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞所附著的培養(yǎng)容器的膜的面相面對的培養(yǎng)容器的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞、并對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞施加壓力，而將粘附培養(yǎng)系細(xì)胞從培養(yǎng)容器剝離，只要是此種方法即可，并不受其他的構(gòu)成特別限定。
[0035]S卩，作為對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞施加壓力的途徑，只要是可以使與粘附培養(yǎng)系細(xì)胞所附著的培養(yǎng)容器的膜的面相面對的培養(yǎng)容器的膜的面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞、并對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞施加壓力即可，既可以通過從培養(yǎng)容器的外部施加壓力而對細(xì)胞施加壓力，也可以通過將培養(yǎng)容器內(nèi)的空氣設(shè)為負(fù)壓而對細(xì)胞施加壓力。
[0036]另外，作為從培養(yǎng)容器的外部施加壓力的方法，也可以利用推壓構(gòu)件等推壓培養(yǎng)容器、或利用空氣壓等推壓培養(yǎng)容器。
[0037]以下，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行具體說明。
[0038][第一實(shí)施方式]
[0039]首先，參照圖1及圖2對本發(fā)明的第一實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0040]在圖1的⑴中，示意性地表示出向包含具有撓曲性的膜的培養(yǎng)容器1 (培養(yǎng)袋)中封入培養(yǎng)液2和粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3并載放在裝載臺4上、將推壓構(gòu)件5配置于培養(yǎng)容器1的上方的樣子。粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3附著在培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面而被培養(yǎng)。
[0041]然后，如圖1的⑵所示，利用推壓構(gòu)件5，從上方推壓培養(yǎng)容器1。此時(shí)，使培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的上表面接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3，對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3施加不會損傷粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3的程度的壓力。
[0042]此后，如圖1的(3)所示，當(dāng)使推壓構(gòu)件5離開培養(yǎng)容器1時(shí)，粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3就從培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面剝落。
[0043]此處，附著于培養(yǎng)容器1內(nèi)的膜的底面的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3即使從培養(yǎng)容器1下方摩擦也無法剝離。即，即使從培養(yǎng)容器1的外部對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞所附著的培養(yǎng)容器1的膜的面施加力，也只會對膜造成損傷，或?qū)⑵淅L，無法剝離粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3。
[0044]與此相對，根據(jù)上述的本實(shí)施方式的細(xì)胞剝離方法，可以不使附著于培養(yǎng)袋內(nèi)的粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3損傷，在一定程度上選擇性并且高效地剝離目標(biāo)范圍的細(xì)胞。
[0045]雖然其理由還不明確，然而可以推測，通過像本實(shí)施方式那樣使培養(yǎng)容器1的膜接觸粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3并施加壓力，就會對粘附培養(yǎng)系細(xì)胞作用大于粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3與培養(yǎng)容器1的粘附力的應(yīng)力，從培養(yǎng)容器1分離粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3。
[0046]培養(yǎng)容器1是以軟包裝材料作為材料制成袋狀的、包含具有撓曲性的膜的培養(yǎng)袋。培養(yǎng)容器1由于是用于粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3的培養(yǎng)，因此優(yōu)選具有透氣性，并且為了可以確認(rèn)內(nèi)容物，優(yōu)選一部分或全部具有透明性。作為滿足此種條件的膜的材料，例如可以舉出聚烯經(jīng)、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、苯乙烯系彈性體、聚酯系熱塑性彈性體、硅酮系熱塑性彈性體、硅橡膠等。
[0047]另外，為了可以使粘附培養(yǎng)系細(xì)胞3附著于培養(yǎng)容器1內(nèi)，需要使培養(yǎng)容器1內(nèi)