本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

在機(jī)體對(duì)腫瘤殺傷的過(guò)程中，細(xì)胞免疫是主力。細(xì)胞免疫是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，T淋巴細(xì)胞在對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷的時(shí)候是有MHC限制性的，即CD4+T細(xì)胞只能識(shí)別MHC-II類(lèi)復(fù)合物，CD8+T細(xì)胞只能識(shí)別MHC-I類(lèi)復(fù)合物，兩種T細(xì)胞不能識(shí)別不表達(dá)相應(yīng)MHC的細(xì)胞，所以具有限制性。而非限制殺瘤一般指不需要MHC識(shí)別即可殺傷腫瘤，通常包括NK細(xì)胞和CIK細(xì)胞。

γδT細(xì)胞是一類(lèi)分布于外周血及粘膜組織的非MHC限制性固有T淋巴細(xì)胞，主要分布于腸道上皮、皮膚、脾臟和肝臟，在外周血中所占比例很低。γδT細(xì)胞被證明能夠體外清除血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞和實(shí)體腫瘤尤其是上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞，也能在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。激活的γδT細(xì)胞能在血循環(huán)中持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，有望成為腫瘤的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的候選細(xì)胞亞群。

現(xiàn)有技術(shù)一般是直接分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，然后將PBMC細(xì)胞在含有一定濃度的IL-2或其他白介素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，得到γδT細(xì)胞，并將其作為細(xì)胞制劑，運(yùn)用于臨床。但是這種常用的方法的擴(kuò)增倍數(shù)較低，同時(shí)殺傷活性也不高。

現(xiàn)有專(zhuān)利CN102994448A和CN103756962A均公開(kāi)了一種體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法，區(qū)別在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同，前者是將單個(gè)核細(xì)胞在含有唑來(lái)膦酸、HSP70、IL-7、IL-15、IL-2的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16天，后者是將單個(gè)核細(xì)胞在含有唑來(lái)膦酸、HSP70、TLR7配體、左旋咪唑、IL-7、IL-15、IL-2的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-16天，雖然這兩個(gè)專(zhuān)利所培養(yǎng)的γδT細(xì)胞在殺傷活性方面優(yōu)勢(shì)明顯，但是在細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)方面卻不足，最高不到200倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使得所述培養(yǎng)方法能夠顯著提高γδT細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使得所述培養(yǎng)方法能夠顯著提高γδT細(xì)胞的殺傷活性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使得所述培養(yǎng)方法能夠顯著提高γδT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的含量。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括：

將單個(gè)核細(xì)胞在包含IL-15、OKT-3和的IL-2的無(wú)血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，至誘導(dǎo)出γδT細(xì)胞(一般為6天左右)，然后加入腫瘤細(xì)胞裂解液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)增殖(一般為9天左右)，然后再加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)促進(jìn)γδT細(xì)胞成熟和進(jìn)一步增殖，培養(yǎng)至14天獲得γδT細(xì)胞。

更具體地，所述培養(yǎng)方法按照1-2×10⁶/mL的細(xì)胞密度將單個(gè)核細(xì)胞在包含IL-15、OKT-3和的IL-2的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天加入腫瘤細(xì)胞裂解液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第9天再加入IFN-γ繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至14天獲得γδT細(xì)胞。

針對(duì)現(xiàn)有方法存在的增殖速度不高等問(wèn)題，本發(fā)明在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)γδT細(xì)胞過(guò)程中采用適宜的培養(yǎng)基誘導(dǎo)后采用腫瘤細(xì)胞裂解液和IFN-γ進(jìn)行刺激和致敏，不僅提高了增殖速度，而且提高了殺傷活性和提高了IFN-γ、IL-4的分泌量。其中，組為優(yōu)選，所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含100-1000U/mL的IL-15、50-500μg/mL的OKT-3和100-1000U/mL的IL-2。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含500U/mL的IL-15、100μg/mL的OKT-3和500U/mL的IL-2；或者包含100U/mL的IL-15、500μg/mL的OKT-3和1000U/mL的IL-2；或者包含1000U/mL的IL-15、50μg/mL的OKT-3和100U/mL的IL-2。

作為優(yōu)選，所述無(wú)血清培養(yǎng)基為X-VIVO 15培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，所述腫瘤細(xì)胞裂解液加入量為10-100μg/mL；本發(fā)明所述腫瘤細(xì)胞裂解液進(jìn)一步優(yōu)選為K562細(xì)胞反復(fù)凍融形成的裂解液。

作為優(yōu)選，所述TNF-α加入量10-200ng/mL。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)為在37℃、5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。

本發(fā)明所述單個(gè)核細(xì)胞可采用常規(guī)方法提取獲得，在本發(fā)明中是按照如下方式制備獲得：

采集外周血，離心后收集血漿；將下層血細(xì)胞用生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)賹⑾♂屢杭尤隖icoll分離液離心，離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心，獲得單個(gè)核細(xì)胞。其中，所述培養(yǎng)基為RPMI 1640培養(yǎng)基。

按照本發(fā)明所述培養(yǎng)方法對(duì)外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以現(xiàn)有常規(guī)的方法作為對(duì)照。結(jié)果顯示，在相同細(xì)胞密度前提下，本發(fā)明培養(yǎng)方式在16天細(xì)胞數(shù)可達(dá)到750百萬(wàn)個(gè)左右，擴(kuò)增倍數(shù)為750倍左右，遠(yuǎn)高于對(duì)照的300百萬(wàn)個(gè)左右，擴(kuò)增倍數(shù)為300倍左右。同時(shí)，在細(xì)胞殺傷活性方面以及IFN-γ、IL-4的分泌量方面以顯著優(yōu)于對(duì)照方法。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過(guò)調(diào)整前期誘導(dǎo)培養(yǎng)基的細(xì)胞因子，在培養(yǎng)中后期采用腫瘤細(xì)胞裂解液和IFN-γ進(jìn)行刺激和致敏，不僅提高了細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)，而且提高了殺傷活性和提高了IFN-γ、IL-4的分泌量。

附圖說(shuō)明

圖1所示為不同方法培養(yǎng)的γδT細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果；其中，A表示本發(fā)明方法的結(jié)果，B表示對(duì)照方法的結(jié)果；

圖2所示為不同方法培養(yǎng)的γδT細(xì)胞的形態(tài)圖，放大倍數(shù)為200倍；其中，A為本發(fā)明方法的結(jié)果，B為對(duì)照方法的結(jié)果；

圖3所示為不同方法培養(yǎng)的γδT細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；其中，A曲線為本發(fā)明方法的曲線，B為對(duì)照方法的曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明產(chǎn)品和應(yīng)用已通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

以下就本發(fā)明所提供的一種γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法做進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取分離

采集人外周血20mL，離心后收集血漿；將下層血細(xì)胞用生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)賹⑾♂屢杭尤胍延蠪icoll分離液(購(gòu)至STEM CELL公司)的sepmate離心管(購(gòu)至STEM CELL公司)中，離心10-20min；離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，離心，獲得單個(gè)核細(xì)胞。

實(shí)施例2：本發(fā)明所述培養(yǎng)方法

按照1-2×10⁶/mL的細(xì)胞密度加入X-VIVO 15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入IL-15、OKT-3和IL-2；第6天，加入K562腫瘤細(xì)胞裂解液，對(duì)γδT細(xì)胞進(jìn)行刺激；第9天，加入IFN-γ，對(duì)γδT細(xì)胞進(jìn)行致敏；14天后，獲得γδT細(xì)胞；期間注意補(bǔ)加培養(yǎng)基和細(xì)胞因子。

其中，IL-15、OKT-3和IL-2濃度可選擇如下：

(1)500U/mL的IL-15、100μg/mL的OKT-3和500U/mL的IL-2；

(2)100U/mL的IL-15、500μg/mL的OKT-3和1000U/mL的IL-2；

(3)1000U/mL的IL-15、50μg/mL的OKT-3和100U/mL的IL-2；

實(shí)施例3：流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD56⁺和CD3-

對(duì)照方法：按照1×10⁶/mL的細(xì)胞密度加入X-VIVO 15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入IL-15和IL-2，培養(yǎng)14天后，獲得γδT細(xì)胞；期間注意補(bǔ)加培養(yǎng)基和細(xì)胞因子。

本發(fā)明方法：實(shí)施例2中采用第一種培養(yǎng)基的方法；

取兩種方法培養(yǎng)后的γδT細(xì)胞進(jìn)行CD56和CD3的流式檢測(cè)。流式檢測(cè)方法如下：取1×10⁶個(gè)γδT細(xì)胞；250g離心5min去上清；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；避光加入CD56和CD3抗體2.5μL室溫孵育30min；用含10％FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，實(shí)施例1中γδT細(xì)胞的CD56+CD3+雙陽(yáng)性表達(dá)量為34％，而對(duì)比例1中γδT細(xì)胞的CD56+CD3+雙陽(yáng)性表達(dá)量?jī)H為15.3％。

實(shí)施例4：細(xì)胞增殖對(duì)比

對(duì)照方法和本發(fā)明方法同實(shí)施例3。分別按照兩種方法進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過(guò)程中計(jì)數(shù)和進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

圖2為第7日的細(xì)胞形態(tài)。圖2所示，本發(fā)明方法培養(yǎng)的細(xì)胞中不規(guī)則形狀的細(xì)胞要多于對(duì)照方法。

圖3顯示在培養(yǎng)過(guò)程中，采用本發(fā)明培養(yǎng)方法可顯著增加細(xì)胞的增殖速度，16天細(xì)胞數(shù)可達(dá)到7.5×10⁸個(gè)左右，遠(yuǎn)高于對(duì)照的3.0×10⁸個(gè)左右，兩者的擴(kuò)增倍數(shù)分別為750倍和300倍左右。

實(shí)施例5：檢測(cè)γδT細(xì)胞的殺傷活性

對(duì)照方法和本發(fā)明方法同實(shí)施例3。取兩種方法培養(yǎng)后的γδT細(xì)胞進(jìn)行殺傷活性檢測(cè)。

鋪板時(shí)各實(shí)驗(yàn)孔和對(duì)照設(shè)置如下：

試驗(yàn)孔：按效靶比40:1、20:1和10:1進(jìn)行靶細(xì)胞(K562)和效應(yīng)細(xì)胞(本發(fā)明方法或?qū)φ辗椒ǖ玫降摩忙腡細(xì)胞共培養(yǎng)物)的鋪板。其中，效應(yīng)細(xì)胞的濃度分別為4×10⁶個(gè)/mL，2×10⁶個(gè)/mL，1×10⁶個(gè)/mL，每孔100μL，每組3個(gè)復(fù)孔；K562濃度為1×10⁵個(gè)/mL，每孔100μL，每組3個(gè)復(fù)孔。

效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔：4×10⁶個(gè)/mL，2×10⁶個(gè)/mL，1×10⁶個(gè)/mL，每孔100μL，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μL培養(yǎng)基。

靶細(xì)胞最大釋放孔：1×10⁵個(gè)/mL的靶細(xì)胞，每孔100μL，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μL培養(yǎng)基，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱孵育前45min每孔加入20μL細(xì)胞裂解液。

靶細(xì)胞自然釋放孔：1×10⁵個(gè)/mL的靶細(xì)胞，每孔100μL，每組3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100μL培養(yǎng)基。

培養(yǎng)液空白對(duì)照：每孔200μL培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔。

體積糾正對(duì)照：每孔200μL培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱孵育前45min每孔加入20μL細(xì)胞裂解液。

鋪板后將培養(yǎng)板250g離心4min，置于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱孵育4h。在培養(yǎng)結(jié)束前45min，取出培養(yǎng)板，在靶細(xì)胞最大釋放組和體積糾正組每孔加入20μL細(xì)胞裂解液，250g離心4min，繼續(xù)培養(yǎng)45min后取出。

進(jìn)行LDH(乳酸脫氫酶)測(cè)定，具體步驟如下：250g離心4min，每孔吸出50μL上清轉(zhuǎn)移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μL，室溫避光孵育30min。每孔加入50μL終止液，用振蕩器將色素顆粒打散，測(cè)定490波長(zhǎng)處的吸光度值。

試驗(yàn)組、靶細(xì)胞LDH自然釋放組和效應(yīng)細(xì)胞LDH自然釋放組的吸光度均值減去培養(yǎng)液空白對(duì)比例吸光度值均值，獲得校正值。靶細(xì)胞LDH最大釋放組的吸光度均值減去體積糾正組吸光度值均值，獲得校正值。

殺傷活性按如下公式計(jì)算：

活性＝(A-E-T)/(Tmax-T)×100％

A:試驗(yàn)組吸光度值校正值；

E:效應(yīng)細(xì)胞自然釋放孔吸光度值校正值；

T：靶細(xì)胞自然釋放孔吸光度值校正值；

Tmax：靶細(xì)胞最大釋放組吸光度值校正值。

結(jié)果見(jiàn)下表。

表1殺傷活性對(duì)比

由上表可以明顯看出，本發(fā)明γδT細(xì)胞在不同效靶比下，殺傷活性均遠(yuǎn)高于對(duì)照方法。

實(shí)施例6：檢測(cè)γδT細(xì)胞的IL-4和IFN-γ的表達(dá)量

對(duì)照方法和本發(fā)明方法同實(shí)施例3。

將γδT細(xì)胞培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)液收集起來(lái)進(jìn)行濃縮，為實(shí)驗(yàn)品；分別將IFN-γ和IL-4標(biāo)準(zhǔn)品溶解，分別設(shè)置了5個(gè)濃度，分別是10μg/mL，20μg/mL，30μg/mL、40μg/mL及50μg/mL；從已恢復(fù)到室溫的密封袋中取出實(shí)驗(yàn)所需板條；

留空白孔，提前30min制備生物素化抗體工作液，于10℃～35℃下避光放置；

分別將實(shí)驗(yàn)品或不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(0μg/mL孔加試劑稀釋液)加入相應(yīng)孔中，100μl/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，37℃孵箱孵育90min；

洗板4次：

除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液，100μl/孔。用膠紙封住反應(yīng)孔，于37℃孵箱避光孵育60min；

洗板4次；

除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液，100μl/孔。用膠紙封住反應(yīng)孔，于37℃孵箱避光孵育30min；

洗板4次；

加入顯色底物，100μl/孔，于37℃孵箱避光孵育15min：

加入終止液，100μl/孔，混勻后檢測(cè)其吸光度值(OD₄₅₀值)。

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 IL-4和IFN-γ的表達(dá)量

由上表可以明顯看出，本發(fā)明方法培養(yǎng)的γδT細(xì)胞IL-4和IFN-γ的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照方法。

以上所述只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利的保護(hù)范圍。