透明顫菌血紅蛋白突變體及其在基因工程菌中的可控表達的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可控表達的顫菌血紅蛋白突變體及其重組枯草芽孢桿菌和應(yīng)用， 利用密碼子優(yōu)化后的透明顫菌血紅蛋白突變基因，在枯草芽孢桿菌中用木糖誘導表達，因 而提高了重組枯草芽孢桿菌菌體對氧氣的攝取能力，以提高中溫α-淀粉酶的產(chǎn)量，屬于 基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中溫α-淀粉酶是由枯草芽孢桿菌經(jīng)液體深層發(fā)酵及后提取技術(shù)精制而成的淀 粉酶制劑。此酶以鈣離子為必需因子并作為穩(wěn)定因子和激活因子，也有部分淀粉酶為非鈣 離子依賴型。此酶既作用于直鏈淀粉，亦可作用于支鏈淀粉，無差別地隨機切斷糖鏈內(nèi)部 α-1，4糖苷鍵，能夠?qū)⒌矸鬯獬砷L短不一的糊精及少量的低分子糖類從而使淀粉糊的粘 度迅速下降。廣泛應(yīng)用于淀粉糖、酒精、味精、啤酒、以及飼料、紡織印染退漿等行業(yè)。
[0003] 目前，中溫α-淀粉酶主要生產(chǎn)菌株為枯草芽孢桿菌，其通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)， 而微生物的發(fā)酵過程中，氧氣對好氧微生物的生長繁殖和進行能量物質(zhì)代謝尤為重要，但 微生物只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧，從而使氧氣供應(yīng)成為限制發(fā)酵產(chǎn)量的一大瓶頸。
[0004] 透明顫菌（Vitreoscilla)是一種專性好氧的絲狀革蘭氏陰性細菌，可在池 沼或腐爛的蔬菜中分離得到。此菌可在限氧條件下大量誘導合成透明顫菌血紅蛋白 (Vitreoscillahemoglobin，VHb)，該蛋白是一種氧調(diào)節(jié)蛋白，能特異性的結(jié)合氧氣，并且 高速釋放，從而促進微生物細胞內(nèi)氧的傳遞，提高氧的利用率，這種特性使透明顫菌在有限 空間中能迅速的捕捉氧氣維持其正常的生理代謝。VHb的天然啟動子包括P1和P2兩個部 分，該啟動子受溶氧濃度的誘導，當溶氧降至5%大氣飽和度以下時可強力啟動下游基因表 達（Khoslac，etal.JBacteriol，1989, 171 (11) :5995-6004)。鑒于革蘭氏陽性菌的核糖 體缺少S1蛋白，絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌的基因不能在革蘭氏陽性菌中直接表達。因此，有 必要對VHb進行適當?shù)母脑?，使之能夠適應(yīng)不同的宿主或具有更好的特性。近年來，對VHb 的基因改造已經(jīng)展開，主要包括根據(jù)宿主密碼子偏向性進行合成（吳巧雯，等.中國農(nóng)業(yè) 科學，2004, 37 (10) :1439-1443)、定點突變（KinY，etal.JIndMicrobiolBiotechnol， 2005,32 (4) : 148-54)、易錯PCR(AnderssonCI，etal.BiotechnolBioeng,2000， 70(4):446-55)等方法。另外，在異源表達的過程中所使用的啟動子都是一些起始后不 能再停止的的啟動子，如0-內(nèi)酰胺酶基因啟動子（章銀梅，等.遺傳學報，2〇〇〇,27(2): 183-188)、P43啟動子（廖瑜玲，等.生物技術(shù)通報，2010,9 :176-180)、SacB啟動子（王鳳 寰，等.中國食品學報，2012,12 (8) :11-16)等，同時部分強啟動子的過表達VHb基因會造 成物極必反的效果，也會造成發(fā)酵培養(yǎng)基中有限物質(zhì)的浪費，增加成本。
[0005]Barbarra等用來自巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium)木糖基因的表達元件 構(gòu)建了基于木糖啟動子Pxyl的整合表達載體pAXOl，Pxyl由自己編碼的xylR阻遏蛋白嚴 格控制表達，相對于其他的用IPTG誘導的啟動子如Pspac啟動子，其調(diào)控更嚴謹，誘導效率 更高（Barbarraetal，1996)〇
[0006] 針對枯草芽孢桿菌中中溫α-淀粉酶合成途徑復雜、發(fā)酵過程中需要消耗大量的 氧氣、通過氧化NAD(Ρ)Η或FADH形成NAD(Ρ)或FAD產(chǎn)生能量ΑΤΡ來維持細胞代謝，單純依 靠動力供氧難以滿足其對氧氣的需求問題。本發(fā)明利用來源于透明顫菌、已經(jīng)被廣泛應(yīng)用 證明能提高工業(yè)微生物發(fā)酵過程中氧氣利用效率、降低能耗的血紅蛋白基因vgh，根據(jù)枯草 芽孢桿菌的密碼子偏好性對其進行密碼子優(yōu)化，并用木糖啟動子進行可控表達，來解決中 溫α-淀粉酶發(fā)酵過程中的供氧問題，以提高中溫α-淀粉酶的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一段密碼子優(yōu)化后的透明顫菌血紅蛋白突變基因序列，使其 在重組枯草芽孢桿菌中可控表達，以提高重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)中溫α-淀粉酶的水平。該 重組菌能在木糖誘導下，實現(xiàn)可控表達密碼子優(yōu)化后的透明顫菌血紅蛋白突變基因，因而 提高了重組枯草芽孢桿菌菌體對氧的利用率，減少過多不必要的VHb表達造成物料損耗， 提高中溫α-淀粉酶的產(chǎn)量。
[0008] 本發(fā)明提供一種透明顫菌血紅蛋白（VHb)突變體，其氨基酸序列如SEQIDΝ0 :4 所示，該突變體編碼基因（vgh)的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 將來自于透明顫菌的血紅蛋白基因vgh，按照枯草芽孢桿菌的密碼子偏好性進行 重新設(shè)計及部分基因位點的定點突變后，獲得透明顫菌血紅蛋白突變基因（vgh)，在大腸桿 菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒PBE3的基礎(chǔ)上，加入來源于質(zhì)粒pAXOl中的木糖啟動子序列 和轉(zhuǎn)錄終止信號序列，再加入上述vgh基因序列后，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒PBE-Pxyl-vgb，將此 重組表達質(zhì)粒PBE-Pxyl-vgb電轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，獲得了重組枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis/PBE-Pxyl-vgb)〇
[0011] 原始VHb氨基酸序列SEQIDNO:3中16個位置的氨基酸經(jīng)突變后形成VHb突變 體序列SEQIDN0 :4。采用"原始氨基酸（或堿基）位置替換的氨基酸（或堿基）"來表示 VHb突變體中突變的氨基酸（或堿基），如Glul43Gln，表示位置143的氨基酸由原始VHb的 Glu替換成Gln，位置的編號對應(yīng)于SEQIDN0:3中氨基酸序列編號（或原始vgh基因序列 SEQIDN0 :1中堿基編號），具體如下表所示：
[0012]
[0013] 所述的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，步驟概述如下：
[0014] (1)密碼子優(yōu)化后的Vgh突變基因的獲得：
[0015] 根據(jù)GenBank中公布的透明顫菌血紅蛋白基因vgh核苷酸序列，使用軟件CodonW 軟件包分析基因結(jié)構(gòu)，選擇某些位點進行定點突變及密碼子優(yōu)化后，再通過分析CAI、CBI、 Nc值來初步確定基因序列。通過RNAstructure分析mRNA自由能，結(jié)合枯草芽孢桿菌偏愛 密碼子，最終選擇自由能較低的修改方案，在序列兩端加上BamHl和Sail的酶切位點后，全 合成此基因序列并連接在PMD18-T克隆載體上構(gòu)成重組質(zhì)粒pMD18-T-vgh;
[0016] (2)構(gòu)建枯草芽孢桿菌重組表達載體PBE-Pxyl-vgb:
[0017] 先將來源于質(zhì)粒pAXOl的木糖啟動子Pxyl序列以及轉(zhuǎn)錄終止信號序列通過重疊 延伸PCR獲得融合序列，再把此融合序列連接到大腸桿菌-枯草桿菌穿梭載體PBE3中，構(gòu) 建了PBE-Pxyl表達載體。用BamHl和Sail雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-vgh，膠回收vgh片 段，連接到上述含有木糖醇啟動子的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒PBE-Pxyl中，得到重組 表達質(zhì)粒PBE-Pxyl-vgb;
[0018] (3)重組枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis/PBE-Pxyl-vgb)的獲得：
[0019] 提取質(zhì)粒PBE-Pxyl-vgb，用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌宿主菌株，涂布 含15yg/mL卡那霉素的固體種子平板，30h后長出轉(zhuǎn)化子，即獲得重組枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis/PBE-Pxyl-vgb)〇
[0020] 本發(fā)明還提供一種能夠可控表達所述VHb突變體的重組枯草芽孢桿菌，該菌株于 2015年5月7日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（地址：北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCC No. 10787,分類命名：枯草芽抱桿菌（Bacillussubtilis)。
[0021] 用所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)中溫α-淀粉酶的方法：
[0022] 搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖1% (115°C單獨滅菌20min)，酵母膏1%，玉米淀粉2%， 氯化鈉1 %，磷酸二氫鉀3 %，其余是水；pH6. 8. 0-7. 1，121°C滅菌20min，裝液量25/250ml 三角瓶；
[0023] 上罐發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉9%，豆餅粉3%，玉米漿1%，硫酸銨2%，磷酸二氫 鉀8 %，硫酸鎂0. 3 %，氯化鈣1 %，其余是水；pH6. 8. 0-7. 1，121 °C滅菌20min，裝液量 2. 8L/5L；
[0024] 種子培養(yǎng)條件：于固體培養(yǎng)基平板中挑選枯草芽孢桿菌單菌落接種于種子培養(yǎng)基 中，180r/min，37°C培養(yǎng) 25h;
[0025] 5L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：裝液量2. 8L，接種量8%，37°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速550r/min，通氣量 3L/min，用氨水連續(xù)流加控制pH為7. 0-7