茯苓堿溶液中，開啟冷卻系統(tǒng)，控制溶液的溫度不超過60°C，取代持續(xù)時間5小時左 右；
[0034] (3)中和、醇沉：在酒沉缸加入600kg95 %酒精和72kg乙酸并混合，將茯苓堿液栗 入靜置4小時后，得沉淀物即為羧甲基茯苓多糖。將沉淀取出用75%酒精洗滌3次，放入烘 箱中60度干燥得羧甲基茯苓多糖成品35kg。
[0035] (4)將步驟（3)中產(chǎn)生的上清液用蒸餾塔進行酒精回收，重復利用，少量回收剩余 殘渣主要含氯化鈉、醋酸鈉進行無害化處理。
[0036]經(jīng)檢測本實施例制得的羧甲基茯苓多糖成品中無氯乙酸、雙氧水殘留，水溶性好， 取代度為0. 8,用苯酚硫酸法測得多糖含量為73%。
[0037] 實施例2
[0038] 一種羧甲基茯苓多糖的制備工藝，包括以下步驟：
[0039] (1)制備茯苓堿液：用粉碎機將40kg茯苓片打碎，過20目篩，加自來水80kg在槽 型混合機中浸泡10小時，隨后緩慢加入固體氫氧化鉀120kg，同時不停攪拌，利用堿溶解熱 加速溶解制得茯等喊液；
[0040] (2)脫色、取代反應：將茯苓堿溶液從槽形混合機轉(zhuǎn)移至帶攪拌混合冷熱缸，開動 攪拌，然后緩慢加入26kg雙氧水（35% )脫色，至溶液變白。隨后將40kg固體氯乙酸緩慢加 入茯苓堿溶液中，開啟冷卻系統(tǒng)，控制溶液的溫度不超過60°C，取代持續(xù)時間2小時左右；
[0041] (3)中和、醇沉：在酒沉缸加入1200kg85%酒精和128kg乙酸并混合，將茯苓堿液 栗入靜置4小時后，得沉淀物即為羧甲基茯苓多糖。將沉淀取出用75%酒精洗滌3次，放入 烘箱中60度干燥得羧甲基茯苓多糖成品36kg。
[0042] 經(jīng)檢測本實施例制得的羧甲基茯苓多糖成品中無氯乙酸、雙氧水殘留，水溶性好， 取代度為1. 1，用苯酚硫酸法測得多糖含量為69%。
[0043] 實施例3
[0044] 一種羧甲基茯苓多糖的制備工藝，包括以下步驟：
[0045] (1)制備茯苓堿液：用粉碎機將40kg茯苓片打碎，過20目篩，加自來水80kg在槽 型混合機中浸泡12小時，隨后緩慢加入固體氫氧化鈉80kg，同時不停攪拌，利用堿溶解熱 加速溶解制得茯等喊液；
[0046] (2)脫色、取代反應：將茯苓堿溶液從槽形混合機轉(zhuǎn)移至帶攪拌混合冷熱缸，開動 攪拌，然后緩慢加入l〇kg雙氧水（35%)脫色，至溶液變白。隨后將8kg固體氯乙酸緩慢加 入茯苓堿溶液中，開啟冷卻系統(tǒng)，控制溶液的溫度不超過60°C，取代持續(xù)時間10小時左右；
[0047] (3)中和、醇沉：在酒沉缸加入900kg85%酒精和120kg乙酸并混合，將茯苓堿液 栗入靜置4小時后，得沉淀物即為羧甲基茯苓多糖。將沉淀取出用75 %酒精洗滌4次，放入 烘箱中60度干燥得羧甲基茯苓多糖成品30kg。用苯酚硫酸法測得多糖含量為74%。
[0048] 經(jīng)檢測本實施例制得的羧甲基茯苓多糖成品中無氯乙酸、雙氧水殘留，水溶性好， 取代度為〇. 3,用苯酚硫酸法測得多糖含量為74%。
[0049] 對上述實施例制得的羧甲基茯苓多糖進行功能測試：
[0050] 1、對小鼠移植性S180肉瘤的作用
[0051] 羧甲基茯苓多糖（CMP):上述實施例制得的羧甲基茯苓多糖，臨用前以蒸餾水配 成0. 7mg/ml，7mg/ml的應用濃度。
[0052] 生理鹽水：由廣東大冢制藥有限公司出品
[0053] 動物及飼料
[0054]SPF級NIH系小鼠，體重18~22g，雌雄各半，飼料由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提 供。
[0055] 試驗分組
[0056] 按體重將動物隨機分為：正常對照組、荷瘤對照組、試驗組1、試驗組2、試驗組3， 每組10只，雌雄各半。
[0057]劑量設(shè)置：CMP:小鼠10mg/kg·d(低），100mg/kg·d(高），根據(jù)保健食品人體服 用量計算方式，相當于成人服用等效劑量為60mg/d-600mg/d。小鼠給藥體積按0. 2ml/10g計。
[0058] 試驗方法
[0059] 給藥：每日給藥1次，按體重灌胃給藥，0. 2ml/10g，連續(xù)給藥15天，正常對照組給 予等體積蒸餾水，試驗組1、2、3分別給予實施例1、2、3制得的CMP。期間注意觀察動物的一 般狀況（活動、毛色、食量等）。
[0060] 接種腫瘤：試驗第1天取第3次腹腔傳代S180肉瘤株的小鼠腹水，以無菌蒸餾水 作1 : 3稀釋（細胞數(shù)約為1X106個），然后在每只受試小鼠右前肢腋部皮下接種0.2ml 上述細胞懸液。
[0061] 測定瘤重：試驗第16天，稱取體重，然后脫頸椎處死動物，剖取腫瘤組織，精確稱 取其重量，比較各組腫瘤濕重和體重，按以下公式計算腫瘤抑制率。
[0062]
[0063] 數(shù)據(jù)處理
[0064] 按統(tǒng)計學方法分析和處理數(shù)據(jù)，組間差異比較采用t檢驗（下同）。
[0065] 結(jié)果
[0066] 與荷瘤對照組比較，各實驗組腫瘤濕重均顯著降低（P< 0.05-0. 01)，低劑量時， 腫瘤抑制率分別為39. 0%，高劑量時的腫瘤抑制率為56. 5%，提示CMP對小鼠移植性S180 肉瘤具有一定的抑制作用。試驗結(jié)果詳見表1。
[0067] 表1CMP對小鼠移植性S180腫瘤濕重和體重的影響& 土s)
[0068]
[0069] 注：與模型對照組比較，*P< 0· 05,#P< 0· 01
[0070] 2、對小鼠碳廓清能力的影響
[0071] 試劑
[0072] 注射用環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司出品，批號：07091821(下同）。以注 射用生理鹽水配成6mg/ml的濃度。
[0073] 中華墨汁：200g/瓶，北京一得閣工貿(mào)集團產(chǎn)，型號：P804。臨用前1天，用生理鹽 水稀釋成1 : 5的濃度，以單層濾紙過濾后裝瓶備用。
[0074]0. 1 %Na2C03:以天平準確稱取Na2C030. 5g，加蒸餾水溶解至500ml，充分混勾，密封 保存?zhèn)溆谩?br>[0075] 動物及飼料
[0076]SPF級NIH系小鼠，體重18~22g，雄性，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，飼料由 廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。
[0077] 試驗分組劑量同上
[0078] 試驗方法
[0079] 每日給藥1次，按體重灌胃給藥，0. 2ml/10g，連續(xù)給藥15天，正常對照組給予等體 積蒸餾水，試驗組1、2、3分別給予實施例1、2、3制得的CMP。試驗第10天，腹腔注射環(huán)磷 酰胺120mg/kg造成免疫功能低下模型。試驗第16天各組小鼠尾靜脈注射1 : 5稀釋墨汁 0.lml/10g。分別于注射后2min、20min用抗凝毛細管在眶后靜脈叢取血20μ1，放入盛有 2ml0.l%Na2C03溶液的試管中，搖勻。取血完畢后，脫頸椎處死小鼠，取其肝臟和脾臟立即 稱重（濕重）。取所得~ &20)3溶液0. 25ml，加入多功能酶標板中，在570nm波長下測量其光 密度（0D)。按下式計算廓清指數(shù)K和校正廓清指數(shù)α，以校正廓清指數(shù)α表示碳廓清能 力。
[0080]
[0081] 結(jié)果
[0082] 與模型對照組比較，各實驗組的校正廓清指數(shù)α顯著性升高（Ρ< 0. 01-0. 001)。 試驗結(jié)果詳見表2。
[0083] 表2CMP對小鼠碳廊清能力的影響(X±s)
[0084]
[0085] 注：與正常組比較，#Ρ<(λ05;與模型組比較，#Ρ<(λ01，<(λ001
[0086] 3、CMP對小鼠溶血素生成的影響
[0087] 試驗方法
[0088] 每日給藥1次，按體重灌胃給藥，0. 2ml/10g，連續(xù)給藥15天，正常對照組給予等體 積蒸餾水，實驗組1、2、3分別給予實施例1、2、3制得的CMP。試驗第12天，腹腔注射環(huán)磷酰 胺100mg/kg，造成免疫功能低下模型；同時，各組小鼠腹腔注射5%SRBC0. 25ml/10g進行 致敏。試驗第16天，稱取小鼠體重后摘眼球放血，取全血20μ1，加入盛有2ml生理鹽水的 試管中搖勻，2000rpm，離心lOmin。取上清200μ1，加入盛有2. 5%SRBC、1 : 10豚鼠補體 各250μ1的試管中，混勻，為待測樣品；以生理鹽水為空白樣品。各樣品37°C水浴40min。 然后置試管于冰水中l(wèi)Omin，使反應終止。之后，2000rpm，離心lOmin，取上清200μ1，以空 白樣品調(diào)零，用酶標儀在540nm波長處測定待測樣品0D值。同時，取小鼠胸腺、脾臟稱重， 以每l〇g小鼠的脾臟和胸腺濕重（mg)作為脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。
[0089] 結(jié)果
[0090] 與正常對照組比較，模型對照組的溶血素生成量顯著下降（P< 0. 001)，表明免疫