玉米ZmWx基因在提高玉米產(chǎn)量和改良籽粒性狀中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬作物生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種玉米ZmWx基因在提高玉米產(chǎn) 量和改良籽粒性狀中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 淀粉是人類食物不可或缺的組成成分，也是食品工業(yè)和化學(xué)工業(yè)的重要原材料， 在人類生活中扮演著重要角色。隨著淀粉加工工業(yè)的快速發(fā)展，淀粉的用途不斷擴寬，特別 是燃料乙醇的生產(chǎn)，致使淀粉的需求量急劇攀升。玉米作為全世界第一大作物，其產(chǎn)量高于 小麥和水稻，并且在各種作物淀粉中，玉米淀粉具有最佳的化學(xué)組成，產(chǎn)量最高。2013年全 球淀粉產(chǎn)量約6880萬噸，其中玉米淀粉約6100萬噸，占總量的89%。我國淀粉加工業(yè)90% 以上以玉米為原材料。在普通玉米籽粒中，淀粉含量一般在65%左右。淀粉含量高于74% 的高淀粉玉米具有良好工業(yè)用途。目前我國主要推廣的高淀粉玉米以混合型高淀粉玉米為 主，其粒重、胚乳重均高于普通玉米，且胚乳所占比例較大，籽粒蛋白含量與普通玉米差異 不大，但粗脂肪含量低于普通玉米。
[0003] 淀粉是葡萄糖分子通過α-1，4糖苷鍵或α-1，6糖苷鍵聚合而成的大分子碳水化 合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。普通玉米籽粒淀粉中，直鏈淀粉一般 占25-30%，支鏈淀粉占70-75%。直鏈淀粉分子量較小，一般是由200-5000個葡萄糖單 位以α-1，4糖苷鍵構(gòu)成的線性分子，只含少量分支（平均每1000個葡萄糖單位中少于一 個）。普通玉米直鏈淀粉的聚合度一般為230-2370,與水稻直鏈淀粉類似，而馬鈴薯直鏈淀 粉的聚合度較大，一般為970-9770(HanashiroandTakeda1998)。支鏈淀粉多數(shù)分子量 大，一般由5000個以上葡萄糖單位組成，含有較多分支，分支點處以α-1，6糖苷鍵連接，分 支鏈的長度從6-100DP(聚合度，degreeofpolymerization)不等。玉米支鏈淀粉的數(shù)均 聚合度（DPn)為15900,其大型、中型和小型分子的DPn分別為26500、8400、1100,摩爾分?jǐn)?shù) 分別為54%、16%、30%;質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為90%、8%、2%〇^1?5(^6丨31.2003)。直鏈淀粉 與支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)特點決定了二者具有較大的理化特性差異。
[0004] 淀粉的分子結(jié)構(gòu)決定了淀粉的蒸煮品質(zhì)和工業(yè)用途，結(jié)構(gòu)參數(shù)包括直鏈淀粉/支 鏈淀粉比例（直/支比）、直鏈淀粉聚合度以及支鏈淀粉分支鏈長和分布。其中直/支比 對淀粉特性和用途影響最大，高純度的支鏈淀粉或直鏈淀粉更能滿足食品和工業(yè)加工的不 同需求。支鏈淀粉具有較大的粘度和膨脹系數(shù)，應(yīng)用于食品加工中能增加粘糯口感和膨化 食品的體積，并且在工業(yè)領(lǐng)域多作為粘合劑使用。直鏈淀粉相比于支鏈淀粉，用途更加廣 泛，以其具有不溶于水特性、低粘度、較高的糊化溫度、良好的成膜性、抗?jié)櫭浶?、高穩(wěn)定性， 成為了糖果、造紙、紡織、制藥、和塑料生產(chǎn)領(lǐng)域理想的原材料。尤其是直鏈淀粉可以被應(yīng)用 于生產(chǎn)光解型農(nóng)用塑料薄膜，能夠取代傳統(tǒng)的不可降解塑料，有效減少"白色污染"，是全球 都關(guān)注的熱點產(chǎn)品。近年來，以直鏈淀粉為原料生產(chǎn)的抗性淀粉成為飲食健康方面的新焦 點?？剐缘矸劬哂蓄愃粕攀忱w維的結(jié)構(gòu)特性，在小腸內(nèi)不能被消化水解為葡萄糖，不易進入 循環(huán)系統(tǒng)而使血糖增高。因此，抗性淀粉是糖尿病人的理想食品，同時也可被開發(fā)為健康有 效的減肥食品。由此，越來越多的研究人員致力于直鏈淀粉的提純和高直鏈淀粉作物的育 種工作。
[0005] 在禾谷類胚乳中淀粉的合成是一個多酶催化的復(fù)雜過程，主要涉及四大類酶： ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase)、淀粉合成酶（SSs)、淀粉分支酶（SBEs)、淀粉去分支酶 (DBEs)。這四大類酶都包括許多家族成員，各成員又有精細分工，在淀粉合成過程中發(fā)揮不 同的作用。近年來，隨著大量淀粉合成相關(guān)酶類突變體的發(fā)現(xiàn)和基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展， 結(jié)合正向遺傳學(xué)與反向遺傳學(xué)分析，學(xué)者們對各類酶及家族成員的表達模式、結(jié)構(gòu)、亞細胞 定位、催化特性以及表達調(diào)控等的研究取得了長足進展。
[0006] 直鏈淀粉主要是由顆粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSSI負責(zé)合成的。淀粉合成酶將 ADPG(ADP-葡萄糖）中的葡萄糖基添加到支鏈淀粉的分支鏈或直鏈淀粉的非還原性末端。 淀粉合成酶可分為5個家族：SSI、SSII、SSIII、SSIV和GBSS。它們分別延伸支鏈淀粉中 不同聚合度的支鏈，或者延伸線性的直鏈淀粉鏈。GBSS家族有兩個成員：GBSSI和GBSSII。 GBSSI由Wx基因編碼，主要負責(zé)胚乳和花粉粒中直鏈淀粉的合成。GBSSII主要在葉片中表 達，負責(zé)非儲藏器官中的直鏈淀粉的合成。在玉米、小麥、水稻、馬鈴薯的GBSSI缺失突變體 中，貯藏器官淀粉粒中僅含有支鏈淀粉組分，幾乎不含有直鏈淀粉成分。在這些突變體中， 直鏈淀粉的缺失不影響淀粉粒的表型，這表明只有支鏈淀粉是淀粉粒結(jié)構(gòu)不可或缺的組成 部分（Zeemanetal. 2010)。GBSSI區(qū)別于其他家族淀粉合成酶的兩大特征是它僅限于淀 粉粒的嚴(yán)格亞細胞定位和它發(fā)揮作用的模式。與可溶性淀粉合成酶不同，GBSSI是唯一能 夠連續(xù)地延伸直鏈淀粉的淀粉合成酶，生成長的寡糖鏈。與此相反，其它淀粉合成酶在淀粉 粒中和淀粉體基質(zhì)中均有定位，只負責(zé)支鏈淀粉分支鏈的合成，不能合成直鏈淀粉。
[0007] 越來越多的證據(jù)表明，在高等植物中，GBSSI負責(zé)的直鏈淀粉合成起始于引子 M0S(Denyeretal. 1996)。68331合成直鏈淀粉的能力表現(xiàn)為既能夠利用低聚麥芽糖（105) 為引物合成直鏈淀粉，也能夠作用于支鏈淀粉的側(cè)鏈，負責(zé)超長鏈的合成。在碘結(jié)合法測定 直鏈淀粉含量時，支鏈淀粉中的超長鏈也被算作為表觀直鏈淀粉含量的一部分。將正常的 Wx基因?qū)胨緒x突變體中，胚乳表觀直鏈淀粉含量增加至22 %左右，而其中真正的直鏈 淀粉含量為16%左右，其它部分為超長鏈，表明Wx基因的導(dǎo)入對支鏈淀粉最大的影響是增 加了超長鏈含量（Hanashiroetal.2008)。在小麥和馬鈴薯中也有類似的報道（Kitahara etal. 2007) 〇
[0008] 在高等植物淀粉儲存器官發(fā)育中，直鏈淀粉含量的增加開始于發(fā)育中后期。在玉 米中，胚乳直鏈淀粉的含量在授粉后14天到28天中由18%增加到26. 5%。有4類因素影 響GBSSI合成直鏈淀粉的能力，即有功能的Wx基因拷貝數(shù)及其轉(zhuǎn)錄本、對引物M0S的親和 力、底物ADPG含量和淀粉粒中支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)特性。在玉米突變體胚乳中，有功能的Wx基 因拷貝數(shù)與GBSSI酶活性以及直鏈淀粉含量（AC)成正相關(guān)，其中Wx基因拷貝數(shù)與酶活性 成線性關(guān)系（Tsai1974)。盡管其它淀粉合成酶也能在M0S上添加一個葡萄糖基，但這之后 淀粉合成酶（SS)與低聚麥芽糖解離，不能再繼續(xù)延長，而GBSSI能夠一個接一個地連續(xù)將 葡萄糖基連入M0S直至合成直鏈淀粉。GBSSI對M0S的親和力是其它淀粉合成酶的20倍以 上，因此，在體內(nèi)M0S濃度很低的情況下GBSSI仍能夠有效地結(jié)合M0S并使之延伸。Denyer 等還發(fā)現(xiàn)離體的可溶性GBSSI對M0S的親和力非常低并且不再能持續(xù)地延伸M0S，然而當(dāng) 向體系中加入少量支鏈淀粉時，GBSSI對M0S的親和力提高并能夠持續(xù)延伸。這表明GBSSI 對MOS的重要且獨特的特性可能依賴于與淀粉粒中支鏈淀粉網(wǎng)格的相互作用。
[0009] ADPG作為底物其濃度是影響GBSSI合成直鏈淀粉能力的另一重要因素。熱力學(xué) 分析和實驗證據(jù)表明，ADPG的供應(yīng)狀態(tài)限制體內(nèi)直鏈淀粉的合成。相比于負責(zé)支鏈淀粉 合成的其他淀粉合成酶，GBSSI對ADPG的親和力低，例如在豌豆中GBSSI對ADPG的&為 1. 4mmol/L，而其它SS對ADPG的K"在0. 06-0. 6mmol/L。在淀粉體內(nèi)ADPG的濃度接近于其 它SS催化反應(yīng)的飽和值，而低于GBSSI的適宜底物濃度。在ADPG合成受阻突變體中，直鏈 淀粉含量降低幅度大于支鏈淀粉含量降低的幅度?？梢哉fADPG含量是限制直鏈淀粉合成 的一個重要因素。然而缺乏玉米胚乳中該方面的研究報道。
[0010] GBSSI隨著淀粉粒的生長而被固定在其中，不能像其它SS那樣在淀粉體基質(zhì)中移 動。淀粉粒中支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)矩陣能夠通過多種方式來影響GBSSI活性以及直鏈淀粉含 量。支鏈淀粉的密集矩陣對ADPG和M0S的滲透有阻礙作用，隨著與淀粉粒表層距離的增 加，ADPG和M0S的濃度隨之減少，造成GBSSI的底物供應(yīng)不足。然而這種緊密的矩陣也使 得GBSSI新合成的聚合度較低的M0S被困在GBSSI周圍而不易擴散出去，有利于GBSSI催 化形成的多聚糖鏈的持續(xù)延伸。因此，支鏈淀粉結(jié)構(gòu)的存在不僅賦予了GBSSI能有效結(jié)合 并延伸M0S的動力學(xué)特性，也影響了ADPG和M0S的滲透性，影響GBSSI的酶活力。這解釋 了為什么在普通淀粉粒中直鏈淀粉含量僅在25-30%左右而不再提高。
[0011] 對GBSSI的缺失突變以及抑制Wx基因表達的研究表明，GBSSI酶活性與直鏈淀 粉含量成正相關(guān)。Wx基因功能的完全缺失將導(dǎo)致直鏈淀粉含量的嚴(yán)重降低（0-5%)，甚 至致使淀粉中僅含有100%支鏈淀粉。盡管GBSSI對直鏈淀粉的合成有如此重要的的作 用，但是對Wx基因的過表達是否影響籽粒直鏈淀粉含量報道很少。Sestili等報道將小麥 Wx-B1基因通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)入硬粒小麥中，轉(zhuǎn)基因小麥的直鏈淀粉含量并沒有明顯提 高（Sestilietal.2012)，推測在硬粒小麥中2種不同的GBSSI亞型（Wx-Al、Wx-Bl)可提 供足夠的酶活性催化直鏈淀粉合成，在小麥中過表達Wx-Bl基因?qū)χ辨湹矸酆康挠绊懯?分有限。由于GBSSI蛋白隨著淀粉粒的生長而被固定在其中，不能像其它SS那樣在淀粉體 基質(zhì)中移動，其周圍可被利用的底物數(shù)量有限，因此，增加GBSSI蛋白在胚乳中的豐度以提 高直鏈淀粉合成能力仍是值得關(guān)注的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對目前的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明要解決的問題是提供玉米ZmWx基因在提高玉米產(chǎn) 量和改良籽粒性狀中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明中，從NCBI數(shù)據(jù)庫和玉米基因組測序資料中查詢獲取玉米ZmWx基因（編 碼顆粒結(jié)合型淀粉合成酶GBSSI)的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)玉米中只有一種GBSSI蛋白。對后者 的編碼序列進行GC%分析發(fā)現(xiàn)，其GC%高達66. 36%。
[0014] 以玉米胚乳cDNA為模板，根據(jù)玉米基因組測序資料設(shè)計引物擴增ZmWx基因全 長序列。由于GC含量高，用普通高保真酶未能擴增出來目的片段；改用LA Taq酶配合GC buffer II成功克隆出ZmWx基因全長序列。將所述全長序列連入pEASY-Blunt克隆載體后 送交測序。擴增出的ZmWx基因含有完整的編碼序列，但有3堿基與數(shù)據(jù)庫中序列不一致，其 編碼的氨基酸未發(fā)生改變。這些差異可能是由于cDNA模板的供體為自交系鄭58,其ZmWx 基因與自交系B73的序列存在單核苷酸多態(tài)性所導(dǎo)致。
[0015] 本發(fā)明所述玉米ZmWx基因在提高玉米產(chǎn)量和改良籽粒性狀中的應(yīng)用。
[0016] 其中：所