一種編碼千金子高蛋氨酸蛋白的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種千金子植物中編碼高蛋氨酸蛋白的基因，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫是僅次于氮、磷、鉀的植物必需的第4大營養(yǎng)元素，缺硫時蛋白質(zhì)合成受阻，導(dǎo) 致非蛋白氮累積，不僅影響作物生長，而且降低農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)；植物含硫量為〇. 1%~〇. 5%， 其變幅明顯受植物種類、品種、器官和生育期的影響。十字花科植物需硫最多，豆科、百合 科植物次之，禾本科植物較少（陸景陵，1994)。含硫氨基酸如甲硫氨酸（也稱為蛋氨酸， methionine，Met)、胱氨酸、半胱氨酸（cysteine，Cys)等是合成蛋白質(zhì)的重要氨基酸；蛋白 質(zhì)中含硫氨基酸的含量與種子萌發(fā)、生長和作物品質(zhì)均有密切關(guān)系。其中，Met作為人體和 單瘤胃動物的必需氨基酸之一，在水稻、小麥、大麥、養(yǎng)麥，尤其是豆類和花生等主要的糧食 作物和經(jīng)濟(jì)作物中含量極低，是主要的限制性氨基酸，因此提高這些作物的Met含量顯得 尤為重要（趙文明，1995;MilntzK，1998)。
[0003] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過擴(kuò)大篩選獲得更多高含硫氨基酸的目的基因，利 用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法揭示高M(jìn)et種子貯藏蛋白新的功能（王文軍等，2005)，結(jié)合植物基因 工程的手段改良作物品質(zhì)、調(diào)節(jié)種子生長發(fā)育等將更具實(shí)際意義（HaftBK，2005)。
[0004]目前國際上已經(jīng)分離出來可供用來提高作物Met含量的高M(jìn)et植物種子貯藏蛋白 基因為數(shù)不多，其主要來源是玉米（AltenbachSB，1990)和水稻（Masum-uraT，1989)，此 外還有少部分來自巴西栗（Saalbach1，1994)、花生（BashaSΜ，1994)等，我國尤其落后， 因而充分利用我國豐富的種質(zhì)資源，合理與有效的發(fā)掘和利用植物資源，分離提取有價值 的高M(jìn)et植物種子貯藏蛋白基因是以提高作物Met含量為目的品質(zhì)改良基因工程領(lǐng)域迫切 需要的基礎(chǔ)性工作，也將為高M(jìn)et植物種子貯藏蛋白的研究開辟新的領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種編碼高蛋氨酸蛋白的千金子基因QJZ-HM及其編碼高蛋氨酸蛋白 的應(yīng)用；該基因能提尚尚蛋氣酸蛋白的表達(dá)，尤其是能夠提尚植物中蛋氣酸的含量。
[0006] 本發(fā)明通過設(shè)計出引物，以千金子DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到該基因全長序列，經(jīng) T載體克隆并測序，再轉(zhuǎn)入大豆進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)，表明這是一條編碼高蛋氨酸蛋白的基因。該基 因編碼區(qū)為405bp，編碼135個氨基酸，其中含有13個蛋氨酸，并且在該蛋白中蛋氨酸的摩 爾百分含量達(dá)到9. 62%。
[0007] 因此，本發(fā)明第一個目的是提供一種編碼高蛋氨酸蛋白的千金子基因QJZ-HM，其 屬于新的編碼高蛋氨酸蛋白基因，具有或選自SEQIDNO: 1的序列?；蚺cSEQIDNo: 1限 定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQIDNo: 1限 定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0008] 本發(fā)明第二個目的是提供所述基因所編碼的功能蛋白，其具有或選自SEQID N0:2的蛋白序列，或具有或選自SEQIDNO: 1的基因序列所編碼的蛋白序列?；蚺cSEQID No:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十二個氨基酸殘基的取代或缺失或添加且對植物的生長 發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明第三個目的是提供所述基因或功能蛋白，在調(diào)控千金子高蛋氨酸蛋白表達(dá) 中的用途；利用該基因，開發(fā)更高效、無毒的千金子來源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用 蛋白乃至保健品。
[0010] 在具體實(shí)施方案中QJZ-HM基因及其調(diào)控元件的表達(dá)載體。
[0011] 在具體實(shí)施方案中QJZ-HM基因及其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0012] 在具體實(shí)施方案中QJZ-HM基因及其調(diào)控元件的工程菌。
[0013] 在具體實(shí)施方案中QJZ-HM基因及其調(diào)控元件中任一片段的引物對。
[0014] 在具體實(shí)施方案中QJZ-HM基因及其調(diào)控元件中在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。
[0015] 在具體實(shí)施方案中QJZ-HM基因及其蛋白可應(yīng)用于植物包括單子葉植物和雙子葉 植物。
【附圖說明】
[0016] 圖1為PCR基因擴(kuò)增結(jié)果（1為千金子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，Μ為DNAMarker)。
[0017] 圖2為酶切結(jié)果（1為提取的重組質(zhì)粒，2為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，Μ為DNAMarker)。
[0018] 圖3pCAMBIA1390重組質(zhì)粒中連接不意圖（L.JaponicusUbiquitinpromoter PCAMBIA1390)，其中QJZ-HM為千金子高蛋氨酸基因。
[0019] 技術(shù)效果
[0020] 1、利用本發(fā)明的QJZ-HM基因表達(dá)得到含有13個蛋氨酸的蛋白質(zhì)，有助于蛋氨酸 在大豆中的含量。
[0021] 2、利用本發(fā)明的QJZ-HM基因基因和蛋白，可用于已有尚蛋氣酸蛋白的研究和應(yīng) 用中，以及開發(fā)高效、無毒的高蛋氨酸蛋白的功能型的蛋白質(zhì)乃至保健品。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，所用的實(shí)驗材料均為千金子（Echinochloacrusgalli L.Beauv. ) 〇
[0023]實(shí)施例1、千金子總RNA提取
[0024] 利用RNA提取分離試劑盒（Invitrogen公司提供）提取千金子苞片中總RNA，其 具體方法是：收集千金子苞片l〇〇mg，立即置于液氮中研磨，加入lmlTrizol試劑，充分混 勾；室溫放置5min;加入0. 2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15s，室溫溫育3min;4°C，12000g離心 15min;上清水相轉(zhuǎn)移到一個新的1. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇沉淀RNA;RNA沉淀用 lml75%乙醇洗滌后溶于適量DEPC處理過的水中，-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 實(shí)施例2、千金子總RNA純化
[0026] 依據(jù)DNaseI試劑盒（ThermoScientific公司提供）依次向?qū)嵤├?獲得的千 金子總RNA中加入6μ1DEPC處理水、10μ1RNA、2ylDNaseIBuffer、2ylDNaseI，混 合均勻后，37°C30min，加入EDTA2yl，65°C10min。
[0027] 實(shí)施例3、千金子RNA逆轉(zhuǎn)錄
[0028]第一鏈合成：依據(jù)PlantRT-PCRKit2· 01 (TaKaRa,Japan)的用戶手冊進(jìn)行。 l-2ng總RNA(大約1-2μ1)，和Kit的各種反轉(zhuǎn)錄試劑混合（MgCl24μ1 ; 10XRNAPCR Buffer2μ1；RNaseInhibitor0.5μ1；RNasefreeWater8.5μ1；dNTPMixture2μ1 ； ReverseTranscriptase1μ1 ；01igodT-Adaptor1μ1) 〇混勾后，42°C30min;99°C5min; 5° °C5min，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0029] 第二鏈合成：根據(jù)生物信息學(xué)提供的序列資料設(shè)計以下引物：
[0030] 5' 端引物（SEQIDNO:3)：5' ~CGGGATCCCGATGGCAGCCAAGATGCTTGC~3,；
[0031] 3' 端引物（SEQIDNO:4)：5' ~CGAGCTCGCTAGAATGCAGCACCAACAAAGGG~3,。
[0032]吸取1μ1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為模板與DNATaq酶混合（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μ1，上游引物 (SEQIDΝ0:3)0·5μ1，下游引物（SEQIDN0:4)0.5yl，Taq0·5μ1，10ΧBuffer2μ1， Mg2+0. 5μl，ddH20 15μ1)進(jìn)行PCR反應(yīng)：94°C5min后進(jìn)入擴(kuò)增程序：94°Clmin、57°Clmin、 72°Clmin, 30 個循環(huán)后，72°C5min。
[0033] 實(shí)施例4、TA克隆
[0034] 將實(shí)施例3中所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳（圖2)分離目的DNA片段， 采用膠回收DNA試劑盒（購自上海生工生物工程有限公司）方法進(jìn)行回收DNA片段，將回 收的第二鏈合成產(chǎn)物與DNA克隆試劑混合（第二鏈產(chǎn)物6μ1，PEG40001μ1，T載體1μ1， 10Χligationbuffer1μl，ligase1μ1)，于 16°C連接過夜。
[0035] 實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和目的DNA片段測序
[0036] 取連接產(chǎn)物5μ1與200μ1大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（購自上海生工生物工程 有限公司）混勻，冰上放置30min，42°C90s，冰浴1-2分鐘，加入800μ1LB培養(yǎng)基，于37°C， 250rpm震蕩培養(yǎng) 45min，4000rpm離心 5min，上清留下約 150μ1，加入 7μ1IPTG，40μ1 x-gal混合均勻，涂布于預(yù)先加入Amp(氨芐青霉素）的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取白 色菌落于加有Amp的LB液體培養(yǎng)基中震蕩過夜，取lml菌液送至上海生工生物工程有限公 司測序。測序結(jié)果表明：擴(kuò)增得到的序列SEQIDNO: 1自起始密碼子到終止密碼子總長390 堿基，編碼129個氨基酸，推測分子量為14. 2kD，等電點(diǎn)8. 74,編碼蛋氨酸17個，蛋氨酸的 百分摩爾含量為13. 18%。
[0037] 實(shí)施例6、將目的DNA片段導(dǎo)入大豆中進(jìn)行強(qiáng)表達(dá)
[0038] 從上述含有QJZ-HM基因的菌液中提取質(zhì)粒，用XbaI和BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切 產(chǎn)物經(jīng)回收后，與同樣經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切回收的pCAMBIA1390質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建 重組質(zhì)粒（如圖3);將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌AGL1，通過Kan和Rif篩選出轉(zhuǎn)化成功的 AGL1菌株，并將其侵染大豆（購自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆種質(zhì)資源中心）子葉節(jié)，利用潮霉 素篩選獲得QJZ-HM基因轉(zhuǎn)染成功的大豆幼苗，并經(jīng)培養(yǎng)獲得大豆種子，通過氨基酸分析儀 檢測大豆種子Met含量，發(fā)現(xiàn)其Met含量由對照的0. 651 %提高至3. 968%，表明QJZ-HM基 因在大豆中得到了強(qiáng)表達(dá)。
[0039]SEQIDNO: 1基因序列表如下：
[0040]
[0041] SEQIDNO:2氨基酸序列表如下：
[0042]
[0043]
【主權(quán)項】
1. 一種編碼千金子高蛋氨酸蛋白的基因及其應(yīng)用，其特征在于為下述核苷酸序列之一 的基因： (1) SEQ ID No:l； (2)與SEQ ID No: 1限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID No: 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1所述QJZ-HM基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，其特征在于為下述氨基酸殘基序列之 (1) SEQ ID No:2； (2) SEQ ID No:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十二個氨基酸殘基的取代或缺失或添加 且對植物的生長發(fā)育具有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)。3.含有權(quán)利要求1所述的QJZ-HM基因及其調(diào)控元件的表達(dá)載體。4.含有權(quán)利要求1所述的QJZ-HM基因及其調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。5.含有權(quán)利要求1所述的QJZ-HM基因及其調(diào)控元件的工程菌。6.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述的QJZ-HM基因及其調(diào)控元件中任一片段的引物對。7.權(quán)利要求1所述的QJZ-HM基因及其調(diào)控元件中在植物生長發(fā)育中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，在調(diào)控千金子高蛋氨酸蛋白表達(dá)中的用途；利用 該基因，開發(fā)更高效、無毒的千金子來源的具有高蛋氨酸蛋白的功能型食用蛋白乃至保健 品。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼千金子高蛋氨酸蛋白的基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。該基因能大大促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，降低非蛋白氮含量，不僅促進(jìn)作物生長，而且提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N1/21, C12N15/70, C12N15/11, C12N15/29, C12N15/82, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/63
【公開號】CN105349552
【申請?zhí)枴緾N201510922187
【發(fā)明人】陳宏偉
【申請人】向華
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月11日