專利名稱：：編碼玉蜀黍除草劑抗性基因的多核苷酸和使用方法編碼玉蜀黍除草劑抗性基因的多核苷酸和使用方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生或增強(qiáng)植物中的除草劑抗性的組合物和方法。此外，本發(fā)明涉及已用本發(fā)明的組合物遺傳轉(zhuǎn)化的植物。
背景技術(shù)：
：在農(nóng)作物的商業(yè)生產(chǎn)中，希望容易且快速地從農(nóng)作物植物的田地中清除不需要的植物(即，"雜草")。理想的處理將是可應(yīng)用于整塊田地但僅清除不需要的植物同時(shí)使農(nóng)作物植物不受傷害的處理。一種這樣的處理系統(tǒng)涉及對除草劑耐受的農(nóng)作物植物的使用。當(dāng)除草劑噴灑在除草劑耐受農(nóng)作物植物的田地上時(shí)，農(nóng)作物植物繼續(xù)茁壯成長而非除草劑耐受雜草被殺死或嚴(yán)重?fù)p害。針對特定除草劑的農(nóng)作物耐受性可以通過將基因工程改造到農(nóng)作物內(nèi)來賦予，所述基因編碼合適的除草劑代謝酶。在一些情況下，這些酶和編碼其的核酸起源于植物。在其他情況下，它們衍生自其他生物，例如微生物。參見例如，Padgette等人(1996)"Newweedcontrolopportunities:DevelopmentofsoybeanswithaRoundUPReadygene"和Vasil(1996)"Phosphinothricin-resistantcrops,"2個(gè)參考文獻(xiàn)都在//eW/c/c/e-W^Wcm/1Oo戸,編輯Duke(CRCPress,BocaRaton,Florida)第54-84頁和第85-91頁。事實(shí)上，轉(zhuǎn)基因植物已進(jìn)行工程改造以表達(dá)來自多種生物的多種除草劑耐受基因，包括編碼大鼠細(xì)胞色素P4507A1和酵母NADPH-細(xì)胞色素P450氧化還原酶的嵌合蛋白質(zhì)的基因(Shiota等人(1994)尸/"W尸/"/。/.106:17)，以及其他植物P450基因(參見，例如，Didierjean,L.等人(2002)PW尸—130:179-189;Morant，M.S.等人(2003)(9/,m顯歷Wec/mo/ogy14:151-162)。賦予針對除草劑耐受性的其他基因包括乙酰羥酸合酶("AHAS"),其已發(fā)現(xiàn)對表達(dá)其的植物賦予針對多個(gè)ALS除草劑類型的抗性，并且已引入多種植物內(nèi)(參見，例如，Hattori等人(1995)M/.Ge".G綴t246:419);谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶(Aono等人(1995)尸/"WCe〃尸/zjw'o/.36:1687);和關(guān)于各種磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Datta等人(1992)尸/贈(zèng)Mo/.腸/.20:619)。盡管除草劑耐受農(nóng)作物植物目前是商購可得的，但農(nóng)作物生產(chǎn)的每個(gè)方面中的改善是持續(xù)需要的。不幸的是，目前商購可得的除草劑和農(nóng)作物都具有可以限制其在商業(yè)農(nóng)作物生產(chǎn)中的有用性的特定特征。特別地，個(gè)別除草劑具有針對常見雜草物種的不同和不完全的活性譜。除草劑的乙酰乳酸合酶或ALS(也稱為AHAS)家族通過抑制氨基酸的支鏈的產(chǎn)生來控制雜草，所述氨基酸是植物生長和發(fā)育所必需的。特別地，它們與植物ALS酶結(jié)合。在這個(gè)家族中常用的除草劑尤其包括煙嘧黃隆、玉嘧黃隆和綠黃隆。這個(gè)種類中的除草劑可以是相當(dāng)農(nóng)作物特異的。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及針對除草劑的ALS抑制類另'J的成員抗性的植物，所述ALS抑制類別包含除草劑的5個(gè)亞類，包括但不限于除草劑的磺酰脲(SU)家族和除草劑的咪唑啉酮家族。除草劑的色素合成抑制類別靶向允許植物合成色素的酶，所述色素例如類胡蘿卜素色素或葉綠素色素。色素的喪失導(dǎo)致葉綠素的光破壞和植物組織的增白，這是許多除草劑常稱為"漂白"除草劑的原因。漂白除草劑的亞類的例子是HPPD抑制類別，這抑制4-羥苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)(Lee等人(1997),e6^&7.45:601-609)。這個(gè)家族的除草劑包括但不限于尤其是硝草酮(mesotrione)、tembotrione、苯吡唑草酉同(topramezone)和磺草酮。由于除草劑的代謝，玉米對硝草酮一般是耐受的(Mitchell等人(2001)尸eWtW^.57:120-128)。相同的解毒系統(tǒng)可以給予針對硝草酮和一些SU除草劑的耐受性(Green&Williams(2004)尸racee(i/wgs腸eJSoc/e(yq/^wen'ca44:13)。植物。、^、、'、'、、'、，、'、，、除草劑的原卟啉原氧化酶(PPO)抑制類別千擾葉綠素的合成，從而導(dǎo)致產(chǎn)生高度活性的化合物(自由基)的化合物。這些活性化合物石皮壞細(xì)月包膜，這導(dǎo)致與這些產(chǎn)物的芽后(post-emergence)應(yīng)用相關(guān)的燒葉。這個(gè)家族中的除草劑包括但不限于尤其是三氟羧草醚、氟黃胺草醚、乳氟禾草靈、磺胺草唑、氟酮唑草、酰亞胺苯氧乙酸和氟囌。秦酮。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及針對除草劑的PPO抑制類別的成員抗性的植物。光系統(tǒng)II(PSII)抑制除草劑具有涉及與光系統(tǒng)II的電子傳遞鏈中的組分相互作用的作用方式。光合作用要求電子從光系統(tǒng)II傳遞到光系統(tǒng)I。這個(gè)電子傳遞鏈中的關(guān)鍵步驟是在類嚢體膜中由D!蛋白質(zhì)還原質(zhì)體醌(PQ)。PSII抑制劑除草劑與Di蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制PQ結(jié)合且中斷電子傳遞過程。這導(dǎo)致植物不能固定二氧化碳且不能產(chǎn)生植物存活所需的碳水化合物。電子傳遞中的阻斷還引起氧化應(yīng)激和引起快速細(xì)胞損傷的自由基的產(chǎn)生。PSII抑制除草劑由幾個(gè)除草劑家族代表，包括均三氮苯、三嗪酮(triazinone)(不對稱的三嗪)、取代的尿素、尿嘧啶、噠嗪酮、氨基甲酸苯酯、腈、苯并噻二唑、苯基噠嗪和酰胺。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及針對除草劑的PSII抑制類別的成員抗性的植物。合成生長素除草劑是廣泛使用的除草劑類別，其模擬由植物生產(chǎn)的天然生長素激素。生長素調(diào)節(jié)許多植物過程，包括細(xì)胞生長和分化。生長素在植物中一般以低濃度呈現(xiàn)。合成生長素除草劑模擬天然生長素且在細(xì)胞中引起相對高的濃度，這導(dǎo)致快速的生長應(yīng)答。用這些除草劑處理的易感植物顯示出可以稱為'生長素超劑量，的癥狀，并且由于增加速度的無規(guī)且不受控制的生長而最終死亡。本發(fā)明的實(shí)施方案涉及針對除草劑的合成生長素類別的成員抗性的植物。本發(fā)明的一些實(shí)施方案基于負(fù)責(zé)玉蜀黍中重要的除草劑抗性機(jī)制的基因的精細(xì)作圖、克隆和表征。已知從20世紀(jì)90年代早期開始，玉蜀黍(玉蜀黍(Ze"wa，)L.)中針對磺酰脲除草劑亞型(煙嘧黃隆[DupontAccent⑧除草劑]、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆和噻黃隆)的天然耐受性受單基因(由Kang(1993X/ow而/84(3):216-217命名為的控制,具有顯性的抗性和隱性的敏感性(Harms等人(1990)77zeoKJ///.80:353-358;Kang(1993)同上；Green&Uhlrich(1993)41:508-516;Green&Uhlrich(1994)40:187-191)。還已知耐受的玉蜀黍植物通過羥基化作用來代謝煙嘧黃隆，具有細(xì)胞色素P450的特征(Fonne-Pfister等人(1990)尸eWc,Je說oc/z綴尸—o/.37:165-173;Brown&Cotterman(1994)C7^w.尸/"w,尸ra/1.10:47-81)。已提出負(fù)責(zé)決定對一些磺酰脲除草劑的耐受性的相同玉米基因還負(fù)責(zé)對苯達(dá)松(Barrett等人(1997)RoleofcytochromeP-450inherbicidemetabolismandselectivityandmultipleherbicidemetabolizingcytochromeP-450activitiesinmaize./"K.K.Hatzios，編輯RegulationofEnzymaticSystemsDetoxifyingXenobioticsinPlants.Dordrecht:KluwerAcademic.第35-50頁；Green(1998)Weed7fec/mo/ogy12:474-477)和HPPD抑制劑除草劑例如硝草酮(Green&Williams(2004)同上；Williams爭乂(2005)//oW&ze"ce40(6):1801-1805)的耐受性。玉蜀黍物理圖譜和整合標(biāo)記的發(fā)展中的近期進(jìn)展(Bortiri爭入(2006)Cwr(9;,"尸/顯fAo/.9(2):164-71)已允許用于鑒定基因座的定位克隆法。本發(fā)明的實(shí)施方案的抗性基因編碼與細(xì)胞色素P450家族相關(guān)的新基因。盡管多種細(xì)胞色素P450基因已得到描述，但它們在其對不同病原體的應(yīng)答和確切作用方面廣泛不同。本公開內(nèi)容中描述的新細(xì)胞色素P450基因已證實(shí)提供針對眾多除草劑改善的耐受性或抗性，所述除草劑包^"煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆、噻黃隆和硝'草酮。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括分離的多核苷酸的實(shí)施方案，所述分離的多核苷酸包含編碼能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性的多肽的核苷酸序列，其中當(dāng)基于Needleman-Wunsch比對算法與SEQIDNO:1比較時(shí)，所述多肽具有至少85、90或95%同一性的氨基酸序列，或所述核苷酸序列的互補(bǔ)體，其中所述互補(bǔ)體和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補(bǔ)的。實(shí)施方案的多核苦酸賦予針對其的抗性的除草劑包括除草劑的ALS抑制類別；色素合成抑制類別；PPO抑制類別；PSII抑制類別；和合成生長素類別的成員。實(shí)施方案的多核苷酸可以賦予針對來自相同類別、或來自不同類別的一種或多種除草劑的抗性，包括來自所有5個(gè)類別的代表性成員。本發(fā)明的另外的實(shí)施方案包括包含實(shí)施方案的多核苷酸的載體，和包含與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接的實(shí)施方案的多核苷酸的重組DNA構(gòu)建體。還包含的是各自包含本發(fā)明的實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞、以及植物和種子。還包括的是包含編碼負(fù)責(zé)目的性狀的多肽的另外多核苷酸的植物，所述多肽例如具有草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽、殺蟲Bt多肽、和其他目的多肽。包含這些多核苷酸的植物包括單子葉植物和雙子葉植物，包括但不限于玉蜀黍、小麥、大麥、燕麥、柳枝稷、高粱、稻、大豆、低芥酸菜子、馬鈴薯、棉花和向日葵。由本發(fā)明具體體現(xiàn)的方法包括1)用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，其包括用本發(fā)明的實(shí)施方案的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，2)用于生產(chǎn)植物的方法，其包括用本發(fā)明的實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物，和3)賦予或增強(qiáng)針對至少一種除草劑的抗性的方法，其包括用本發(fā)明的實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，由此賦予或增強(qiáng)針對至少一種除草劑的抗性，例如除草劑的ALS抑制類別；色素合成抑制類別；PPO抑制類別；PSII抑制類別；和合成生長素類別的成員。此外，本發(fā)明的實(shí)施方案是7^/7序列的變體等位基因，其中特定的單個(gè)氨基酸改變(參見實(shí)施例2)使得該基因不起作用，從而導(dǎo)致對于大多數(shù)玉米對其抗性的至少一種ALS或HPPD抑制劑除草劑的敏感性。因此，由本發(fā)明具體體現(xiàn)的另外方法是使用Wy/7基因的變體作為育種策略中的標(biāo)記的方法，以避免摻入敏感的等位基因。本發(fā)明還包含了改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括(a)用本發(fā)明的實(shí)施方案的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所迷轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性?？梢再x予針對其的抗性的除草劑包括例如除草劑的ALS抑制類別；色素合成抑制類別；PPO抑制類別；PSII抑制類別；和合成生長素類別的成員。實(shí)施方案的多核苷酸可以賦予或增強(qiáng)針對其的抗'hi的除草劑包括但不限于選自除草劑的ALS抑制類別的除草劑，例如煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆、咪草煙、綠黃隆、氯嘧黃隆、醚苯黃隆、氟唑啶草、Y列^口異ff惡氣草、笨口比口生草S同、^黃草S同(sulcatrione)禾口tembotrione。；t匕種除草劑還可以選自自除草劑的PPO抑制類別，例如三氟羧草醚、flumioxan和-黃胺草唑。任選地，此種除草劑可以選自除草劑的PSII抑制類別，例如敵草隆、利谷隆、苯達(dá)松和綠麥隆。此種除草劑還可以選自除草劑的合成生長素類別，例如麥草畏。實(shí)施方案的方法包括測定植物中實(shí)施方案的多核苷酸或基因座的存在的方法，其包含下述的至少一種(a)從植物中分離核酸分子，且通過嘗試擴(kuò)增與多核苷酸同源的序列測定基因是否存在；或(b)從植物中分離核酸分子，且進(jìn)行DNA雜交，或(c)從植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSF1蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，或(d)從植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSF1蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行ELISA測定，由此測定植物中權(quán)利要求1的多核苷酸的存在。實(shí)施方案還包含的是具有針對至少一種除草劑增強(qiáng)的耐受性的植物，其包含在重組DNA構(gòu)建體中的基因。此種植物進(jìn)一步包含第二種除草劑抗性基因，其提供針對選自除草劑類別的除草劑的一定水平的耐受性，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；水平高于由Z含第^^種、除草劑抗性基因但不包含A^/J基因的植物顯示的耐受性水平。實(shí)施方案還包含的是包含基因的大豆植物，其中此種大豆植物還顯示出大豆胞嚢線蟲抗性。此種植物已通過轉(zhuǎn)化或植物育種技術(shù)產(chǎn)生，并且可以已由種質(zhì)進(jìn)行育種，所述種質(zhì)例如選自下述的那些Peking、PI88788、PI89772、PI90763、PI209332、PI頓189A、PI437654、PI438489B、PI467312、PI468916、Hartwig、J87-233、和書f生自所列出的來源中的任何一種的后代。附圖簡述圖1(a-e)是使其與其他已知細(xì)胞色素P450多肽(SEQIDNOs:3-13)比較的實(shí)施方案的多肽序列(SEQIDNO:2)的多重序列比對。圖Id還指出了細(xì)胞色素P450家族的最常見的保守結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:14)的位置。比對中的相同殘基以大寫字母指出。圖2(a-b)是幾種敏感和抗性玉米系的多肽序列的多重序列比對，顯示細(xì)胞色素P450家族的最常見的保守結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:14)以及序列中的變異。發(fā)明詳述本發(fā)明的實(shí)施方案提供了涉及誘導(dǎo)植物中的除草劑抗性的組合物和方法。組合物是賦予或增強(qiáng)針對一個(gè)或多個(gè)除草劑類別的一個(gè)或多個(gè)成員的抗性的新核苦酸和氨基酸序列，包括ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PSII抑制、和合成生長素除草劑類別，其成員包括但不限于煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆和硝草酮。特別地，某些實(shí)施方案提供了具有SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的多肽、及其變體和片段。進(jìn)一步提供了分離的核酸分子、及其變體和片段，其包含編碼SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的核普酸序列。編碼SEQIDNO:2的多肽的天然核普酸序列的一個(gè)例子在SEQIDNO:l中闡述。本文還公開了植物、植物細(xì)胞、種子和微生物，其包含編碼實(shí)施方案的多肽的核苷酸序列。實(shí)施方案的全長多肽(SEQIDNO:2)與細(xì)胞色素P450家族的已知多肽共享不同程度的同源性。特別地，實(shí)施方案的新多肽與從下述分離的細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)共享同源性稻(O少za^"va):登記號XP—469850(SEQIDNO:3),ABC69856(SEQIDNO:4);XP—469849(SEQIDNO:11)和XP—469851(SEQIDNO:12);和XP—469852(SEQIDNO:13)和瑞士黑麥草(Z^/zwmr/g^wm):登記號AAK38080(SEQIDNO:5);AAK38079(SEQIDNO:6);AAK38081(SEQIDNO:7);BAD27508(SEQIDNO:8);BAD27507(SEQIDNO:9)和BAD27506(SEQIDNO:10)。圖1提供了SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列與稻和瑞士黑麥草細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)(SEQIDNOs:3-13)的比對。使用GAP程序進(jìn)行的氨基酸比對指出SEQIDNO:2與稻和瑞士黑麥草細(xì)胞色素P450蛋白質(zhì)共享表1中所示的序列相似性。表l:NSF1肽與其他細(xì)胞色素P450肽的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>植物中的細(xì)胞色素P450基因家族催化植物生物活性分子的生物合成或分解代謝中非常不同且通常復(fù)雜的區(qū)域特異性和/或立體特異性反應(yīng)。(Morant等人(2003)CW.一".說o欣/z.14(2):151-162)。P450s是通過使用來自NADPH的電子催化分子氧的活化的血紅素蛋白。在單獨(dú)的鼠耳芥(爿ra&dc^^A"/^"a)基因組中，存在估計(jì)超過300種細(xì)胞色素P450(Werck-Reichhart等人(2000)7Ve"cfez力尸/a"〖S"e"ce5(3):116-123)。共有的結(jié)構(gòu)特征存在于植物細(xì)胞色素P450中并且照那樣地幫助對其進(jìn)行鑒定。這些特征包括一般在近C端發(fā)現(xiàn)的F-X-X-G-X-R-X-C-X-G(SEQIDNO:14)基序(參見圖Id)。上游約150個(gè)殘基，一般發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)保守基序在A/G-G-X-D/E-T-T/S(SEQIDNO:15)基序后并且對應(yīng)于負(fù)責(zé)氧結(jié)合和激活的肽的區(qū)域。實(shí)施方案的核酸和多肽在用于賦予或增強(qiáng)對植物的除草劑抗,性的方法中有用。因此，本文公開的組合物和方法用于保護(hù)植物不受由除草劑引起的損害。"除草劑抗性，，意指植物或植物細(xì)胞具有比非抗性的植物或細(xì)胞耐受更高濃度的除草劑，或比非抗性的細(xì)胞或植物對某種濃度的除草劑耐受更長時(shí)間的能力。即，除草劑被阻止引起植物損傷，或由除草劑引起的損害降到最低或減弱，例如葉黃化和相關(guān)的產(chǎn)量損失的減少。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本文公開的組合物和方法可以與本領(lǐng)域可用于增加或增強(qiáng)植物除草劑抗性的其他組合物和方法一起使用。術(shù)語"增強(qiáng)"指改善、增加、擴(kuò)增、增大、升高、提高等。在具體方面，實(shí)施方案包括用于賦予或增強(qiáng)植物中的除草劑抗性的方法，其包括將至少一種DNA構(gòu)建體引入植物內(nèi)，其中所述DNA構(gòu)建體包含與驅(qū)動(dòng)在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的編碼實(shí)施方案的除草劑抗性多肽的核苷酸序列。植物表達(dá)所述多肽，從而對植物賦予或增強(qiáng)除草劑抗性，或改善植物的固有水平的抗性。在具體實(shí)施方案中，基因賦予或增強(qiáng)針對ALS抑制、色素合成抑制、PPO抑制、PSII抑制、或合成生長素除草劑類別的至少一種除草劑的抗性，其成員包括但不限于除草劑煙嘧黃隆、玉嘧黃隆、氟嘧黃隆、噻黃隆、苯達(dá)松和硝草酮。實(shí)施方案的多肽的表達(dá)可以靼向特定植物組織，但一般在除草劑抗性的情況下，持續(xù)表達(dá)遍及植物的細(xì)胞是所需的。因此，盡管許多啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中，但一般使用組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子是指導(dǎo)遍及植物的各個(gè)部分并持續(xù)貫穿植物發(fā)育的基因表達(dá)的啟動(dòng)子。如本文所使用的，"核酸"包括提及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核普酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有說明，包含具有天然核普酸的基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，因?yàn)樗鼈円灶愃朴谔烊淮嬖诘暮塑账岬姆绞脚c單鏈核酸雜交。術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換用于指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。實(shí)施方案的多肽可以由本文公開的核酸，或通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來產(chǎn)生。例如，實(shí)施方案的截短的蛋白質(zhì)可以通過在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)實(shí)施方案的重組核酸，或可替代地通過先體外后體內(nèi)程序例如蛋白酶消化和純化的組合來產(chǎn)生。如本文所使用的，術(shù)語"編碼"或"編碼的"當(dāng)在特定核酸的背景下使用時(shí)，意指核酸包含指導(dǎo)核苷酸序列翻譯成特定蛋白質(zhì)的必需信息。蛋白質(zhì)由其編碼的信息由密碼子的使用指定。編碼蛋白質(zhì)的核酸可以包含在核酸的翻譯區(qū)域內(nèi)的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或可以缺乏此種間插的非翻譯序列(例如，如在cDNA中)。本發(fā)明的實(shí)施方案包含分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)組合物。"分離的"或"純化的，，多核苷酸或蛋白質(zhì)，或其生物學(xué)活性部分，相當(dāng)大程度上或基本上不含如在其天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的，通常與多核普酸或蛋白質(zhì)伴隨或相互作用的組分。因此，分離的或純化的多核苷酸或蛋白質(zhì)當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)藥品。最佳地，"分離的"多核苷酸不含天然位于多核苷酸由其衍生的生物的基因組DNA中多核苦酸的側(cè)面的序列(最佳地蛋白質(zhì)編碼序列)(即，位于多核苷酸的5'和3'末端處的序列)。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的多核普酸可以包含小于約5kb、約4kb、約3kb、約2kb、約1kb、約0.5kb或約0.1kb的核苷酸序列，其天然位于多核苷酸由其衍生的細(xì)胞的基因組DNA中多核苷酸的側(cè)面?；旧喜缓?xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括具有小于約30%、約20%、約10%、約5%或約1%(按干重計(jì))污染蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)制劑。當(dāng)實(shí)施方案的蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分重組產(chǎn)生時(shí)，最佳地培養(yǎng)基代表小于約30%、約20%、約10%、約5%或約1%(按干重計(jì))的化學(xué)前體或非目的蛋白質(zhì)的化學(xué)藥品。實(shí)施方案還包含了所公開的核苷酸序列以及由其編碼的蛋白質(zhì)的片段和變體。"片段"意指核普酸序列的部分或氨基酸序列的部分和因此由其編碼的蛋白質(zhì)。核苷酸序列的片段可以編碼保留天然蛋白質(zhì)的生物活性的蛋白質(zhì)片段，且因此具有賦予或增強(qiáng)針對ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PSII抑制、或合成生長素除草劑類別的至少一種除草劑的抗性的能力。可替代地，用作雜交探針的核苷酸序列的片段不必需編碼保留生物活性的片段蛋白質(zhì)。因此，核苷酸序列的片段可以為至少約15個(gè)核苷酸、約50個(gè)核普酸、約100個(gè)核苷酸、和最高達(dá)編碼實(shí)施方案的多肽的全長核苷酸序列。編碼實(shí)施方案多肽的生物活性部分的核苷酸序列的片段將編碼至少約15個(gè)、約25個(gè)、約30個(gè)、約40個(gè)、或約50個(gè)鄰接氨基酸、或最高達(dá)實(shí)施方案的全長多肽中存在的氨基酸總數(shù)目(例如，關(guān)于SEQIDNO:2的521個(gè)氨基酸)。用作雜交探針或PCR引物的核苷酸序列的片段一般無需編碼蛋白質(zhì)的生物活性部分。如本文所使用的，提及特定多核普酸的"全長序列"意指具有天然序列的完整核酸序列。"天然序列"意指內(nèi)源序列，即在生物的基因組中發(fā)現(xiàn)的非工程改造序列。因此，實(shí)施方案的核苷酸序列的片段可以編碼多肽的生物活性部片段:除;劑抗';生多肽的生物活性部分可以通過下述進(jìn)-行制備分離實(shí)施方案的核苷酸序列之一的部分，表達(dá)蛋白質(zhì)的編碼部分且評估蛋白質(zhì)的編碼部分賦予或增強(qiáng)植物中的除草劑抗性的能力。其為實(shí)施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約15個(gè)、約20個(gè)、約50個(gè)、約75個(gè)、約IOO個(gè)或約150個(gè)核苷酸、或最高達(dá)本文公開的全長核香酸序列中存在的核苷酸數(shù)目(例如，關(guān)于SEQIDNO:1的1563個(gè)核苷酸)。"變體"意指基本上相似的序列。對于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。如本文所使用的，"天然"多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到實(shí)施方案的核酸的變體將這樣構(gòu)建，從而使得可讀框被保留。對于多核苷酸，保守變體包括由于遺傳密碼的簡并性，編碼實(shí)施方案的多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位基因變體例如這些可以使用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，如，例如使用如下文所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體多核苷酸還包括合成衍生的多核苷酸，例如通過使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生但仍編碼實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的那些。一般地，如通過本文其他地方描述的序列比對程序和參數(shù)測定的，實(shí)施方案的特定多核苷酸的變體將與那種特定多核苷酸具有至少約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多序列同一性。實(shí)施方案的特定多核普酸(即，參考多核苷酸)的變體還可以通過比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參考多核普酸編碼的多肽之間的百分比序列同一性進(jìn)行評估。因此，例如，公開了編碼與SEQIDNO:2的多肽具有給定百分比序列同一性的多肽的分離的多核苷酸。任何2個(gè)多肽之間的百分比序列同一性可以使用本文其他地方描述的序列比對程序和參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)實(shí)施方案的任何給定多核苷酸對通過比較由它們編碼的2個(gè)多肽共享的百分比序列同一性進(jìn)行評估時(shí)，2個(gè)編碼多肽之間的百分比序列同一性為至少約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多序列同一性。"變體"蛋白質(zhì)意指通過在天然蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失或添加，和/或在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換而衍生自天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。由實(shí)施方案包含的變體蛋白質(zhì)是生物活性的，即它們繼續(xù)具有天然蛋白質(zhì)的所需生物活性，即如本文所描述的賦予或增強(qiáng)植物除草劑抗性的能力。此種變體可以例如起因于遺傳多態(tài)性或人為處理。如通過本文其他地方描述的序列比對程序和參數(shù)測定的，實(shí)施方案的天然蛋白質(zhì)的生物活性變體將與天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更多序列同一性。實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的生物活性變體將與那種蛋白質(zhì)相差少至約1-15個(gè)氨基酸殘基，少至約1-10個(gè)，例如約6-10個(gè)，少至約5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)氨基酸殘基。實(shí)施方案的蛋白質(zhì)可以以各種方式進(jìn)行改變，包括氨基酸置換、缺失、截短和插入。用于此種操作的方法是本領(lǐng)域一般已知的。例如，除草劑抗性蛋白質(zhì)的氨基酸序列變體和片段可以通過DNA中的突變進(jìn)行制備。用于誘變和多核苦酸改變的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，Kunkel(1985)Prac.tV"".爿c^/.Sc/.82:488-492;Kunkel等人(1987)A/"/w^,"五^ywo/.154:367-382;美國專利號4，873,192;Walker禾口Gaastra,纟扁4專(1983)7fec/i打〖'gwesA/o/ecM/orB/o/ogy(MacMillanPublishingCompany,NewYork)以及其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目的蛋白質(zhì)生物活性的合適氨基酸置換的指導(dǎo)可以在引入本文作為參考的Dayhoff等人(1978)爿f/w0/尸toW"Se《we"ceS^wC(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的才莫型中找到。保守置換例如用具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸交換一個(gè)氨基酸可以是最佳的。因此，實(shí)施方案的基因和多核普酸包括天然存在的序列以及突變形式。同樣地，實(shí)施方案的蛋白質(zhì)包含天然存在的蛋白質(zhì)以及其變體和修飾形式。此種變體將繼續(xù)具有賦予或增強(qiáng)植物針對ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PSII抑制、或合成生長素除草劑類別的至少一種除草劑的抗性的所需能力。顯而易見的是，將在編碼變體的DNA中制備的突變必須不使序列超出讀框，且最佳地將不制備可以產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見，EP專利號0075444。本文包含的蛋白質(zhì)序列的缺失、插入和置換不預(yù)期產(chǎn)生蛋白質(zhì)的特征中的根本改變。然而，當(dāng)難以在這樣做之前預(yù)測置換、缺失或插入的確切作用時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解作用將通過篩選已用變體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行評估，以確定對植物的除草劑抗性特征的作用。變體多核苷酸和蛋白質(zhì)還包含衍生自誘變或誘重組程序的序列和蛋白質(zhì)，包括但不限于諸如DNA改組的程序。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)見將改變蛋白質(zhì)對其應(yīng)答的除草劑范圍的修飾。使用此種程序，可以處理一個(gè)或多個(gè)不同的蛋白質(zhì)編碼序列以制備具有所需性質(zhì)的新蛋白質(zhì)。以這種方式，重組多核苷酸的文庫由包含序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸的群體產(chǎn)生，所述序列區(qū)域具有相當(dāng)大序列同一性，且可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組。例如，使用這種方法，編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序可以在實(shí)施方案的蛋白質(zhì)基因和其他已知蛋白質(zhì)基因之間進(jìn)行改組，以獲得編碼具有改善的目的性質(zhì)的蛋白質(zhì)的新基因，例如增加的賦予或增強(qiáng)植物除草劑抗性的能力。關(guān)于此種DNA改組的策略是本4貞i或已^口的。參見，例^口，US2002/0058249;Stemmer(1994)尸rac.A^/.爿cc^.[/&491:10747-10751;Stemmer(1994)A/^w"370:389-391;Cmmeri等人(1997)Atow^說Wec/^.15:436-438;Moore等人(1997U油/.腸/.272:336-347;Zhang等人("，7,rac.胸/.^cad園94:4504-4509;Crameri等人(1998)A^fw"391:288-291;以及美國專利號5,605,793和5,837,458。實(shí)施方案的多核苷酸可以用于分離來自其他生物，特別是其他植物的相應(yīng)序列。以這種方式，諸如PCR、雜交等的方法可以用于基于其與本文所述序列的序列同源性來鑒定此種序列。實(shí)施方案包含了基于其與本文所述完整序列或與其變體和片段的序列同一性而分離的序意指衍生自共同的、祖先基因且由于物;;/成在不同物種中^;:的基因。在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因被認(rèn)為是直向同源物，當(dāng)它們的核苷酸序列和/或它們編碼的蛋白質(zhì)序列共享至少約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或更多序列同一性時(shí)。直向同源物的功能在物種中通常是高度保守的。因此，實(shí)施方案包含了分離的多核苷酸，其編碼賦予或增強(qiáng)植物除草劑抗性的蛋白質(zhì)，且在嚴(yán)格條件下與本文公開的序列、或與其變體或片段雜交。在PCR方法中，寡核普酸引物可以設(shè)計(jì)用于在PCR反應(yīng)中使用，以由從任何目的生物中提取的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。用于設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域一般已知的且在下述參考文獻(xiàn)中公開Sambrook等人(1989)A^o/ecw/arC/om力g,爿丄(260n3"廠yA<fa/7wa/(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)。也參見Innis等人，編輯(1990)尸CWXoco/s,JGw/t/etoMe/7zo(is1am/^p//f7ca/7o朋(AcademicPress,NewYork);Innis和Gelfand,編輯(1995)尸CTara/egze"(AcademicPress,NewYork);以及Innis和Gelfand,編輯(1999)PCRtU"/^^A^wwa/(AcademicPress,NewYork)。PCR的已知方法包括但不限于使用配對引物、嵌套引物、單特異性引物、簡并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。在雜交技術(shù)中，所有或部分已知多核苷酸用作與來自所選擇的生物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群體(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其他相應(yīng)多核苷酸選擇性雜交的探針。雜交探針可以是基因組DNA片I史、cDNA片段、RNA片l殳或其他寡核苷酸，并且可以用可斥企測的基團(tuán)例如32P或任何其他可才企測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。因此，例如，用于雜交的探針可以通過基于實(shí)施方案的多核苷酸使合成寡核苷酸標(biāo)記進(jìn)行制備。用于制備用于雜交以及用于構(gòu)建cDNA和基因組文庫的探針的方法是本領(lǐng)域一般已知的，且公開于Sambrook等人(1989)同上中。例如，本文公開的完整多核苷酸，或其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能夠與相應(yīng)的多核苷酸和信使RNAS特異性雜交的探針。為了達(dá)到在多種條件下的特異性雜交，此種探針包括獨(dú)特的且最佳地長度至少約10個(gè)核苷酸、長度至少約15個(gè)核苷酸、或長度至少約20個(gè)核苷酸苷酸。這種技術(shù)可:用于從所需生物中分離另外的編碼序列，、或作為診斷測定以測定編碼序列在生物中的存在。雜交技術(shù)包括鋪平板DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如Sambrook等人(1989)同上。此種序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。"嚴(yán)格條件，，或"嚴(yán)格雜交條件"意指在其下探針將與其靶序列雜交至比與其他序列可檢測地更大程度(例如，超過背景至少2倍)的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴的且在不同環(huán)境下將是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定與探針100%互補(bǔ)的靼序列(同源探測)?？商娲?，嚴(yán)格條件可以進(jìn)行調(diào)整以允許序列中的一些錯(cuò)配，從而使得檢測較低程度的相似性(異源探測)。一般地，探針長度小于約1000個(gè)核苷酸，最佳地長度小于500個(gè)核普酸。一般地，嚴(yán)格條件將是這樣的，其中鹽濃度在pH7.0-8.3下小于約1.5MNa離子，一般約0.01-1.0MNa離子濃度(或其他鹽)，以及溫度對于短探針(例如，10-50個(gè)核苷酸)為至少約3(TC和對于長探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)為至少約60°C。嚴(yán)才各條件還可以用添加去穩(wěn)定劑例如曱酰胺來達(dá)到。示例性低嚴(yán)格條件包括在37。C下用30-35%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，和在50-55°C下在IX-2XSSC(20XSSC=3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性中等嚴(yán)格條件包括在37。C下在40-45%甲酰胺、l.OMNaCl、1WSDS中雜交，和在55-60°C下在0.5X-IXSSC中洗滌。示例性高嚴(yán)才各條件包括在37t:下在50%曱酰胺、1MNaCl、1%SDS中雜交，和在60-65。C下在0.1XSSC中最終洗滌至少30分鐘。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0.1%-約1%SDS。雜交持續(xù)時(shí)間一般小于約24小時(shí)，通常約4-約12小時(shí)。洗滌時(shí)間的持續(xù)時(shí)間將是至少足以達(dá)到平#f的時(shí)間長度。特異性一般是雜交后洗滌的函數(shù)，臨界因子是離子強(qiáng)度和最終洗滌溶液的溫度。對于DNA-DNA雜交物，熱解鏈溫度(Tm)可以由Meinkoth和Wahl(1984)說oc/z亂138:267-284的等式進(jìn)行估計(jì)Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是一價(jià)陽離子的體積摩爾濃度，。/。GC是DNA中的鳥苷和胞嘧啶核苷酸百分比，。/。form是雜交溶液中的曱酰胺百分比，且L是堿基對中的雜交物的長度。Tm是在其下50%的互補(bǔ)靶序列與完美匹配的探針雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度和pH下)。Tm對于每1%的錯(cuò)配降低約1°C;因此Tm、雜交和/或洗滌條件可以進(jìn)行調(diào)整，以與所需同一性的序列雜交。例如，如果尋找具有^90%同一性的序列，那么Tm可以降低10°C。一般地，在限定的離子強(qiáng)度和pH下，嚴(yán)格條件選擇為比關(guān)于特定序列及其互補(bǔ)體的Tm低約5。C。然而，高度嚴(yán)格條件可以利用在比Tm低l、2、3或4。C的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用在比Tm低6、7、8、9或10。C的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用在比Tm低ll、12、13、14、15或20。C的雜交和/或洗滌。使用等式、雜交和洗滌組合物以及所需Tm,普通技術(shù)人員將理解雜交和/或洗滌溶液中的嚴(yán)格性的變化是固有描述的。如果所需錯(cuò)配程度導(dǎo)致小于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，那么最佳地是增加SSC濃度，從而使得可以使用較高的溫度。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)在Tijssen(1993)Z/a60n2/10/^7fec/wigwe5z力B/oc/zew^;y少A<fo/ecw/"rBio/ogy—T/少^i(3feWoww"/zM/c/e上c爿c/d/Voh',第I邵分，第2章(Elsevier，NewYork);和Ausubel等人,編輯(1995)Cwre"尸ramc0As1/"Mo/ecw/arA'o/ogy,第2章(GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork)中找到。參見Sambrook等人(1989)同上。各種程序可以用于檢查特定DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列的存在或不存在。這些包括例如，DNA印跡、RNA印跡、蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析。諸如這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且存在提供詳細(xì)規(guī)程的許多參考文獻(xiàn)。此種參考文獻(xiàn)包括Sambrook等人(1989)同上和Crowther,J.R.(2001),77ze￡ZJ&4Gw編ooA:,HumanaPress,Totowa,NJ,USA。下述術(shù)語用于描述2個(gè)或更多多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系(a)"參考序列"，(b)"比較窗"，(c)"序列同一性"，和(d)"序列同一性百分比"。(a)如本文所使用的，"參考序列"是用作用于序列比較的基礎(chǔ)的限定序列。參考序列可以是指定序列的亞群或全部；例如，作為全長cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。(b)如本文所使用的，"比較窗"提及多核普酸序列的鄰接和指定區(qū)段，其中就2個(gè)多核苷酸的最佳比對與參考序列(其不包含添加或缺失)比較，比較窗中的多核普酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。一般地，比較窗長度為至少約20個(gè)鄰接核普酸，且任選地可以為約30個(gè)、約40個(gè)、約50個(gè)、約100個(gè)或更長。本領(lǐng)域二技術(shù)人員理解為了避免由于多核苷酸序列中包含缺口而與參考序列的高相似性，一般引入缺口罰分且從匹配數(shù)目中扣除。用于比對比較的序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。因此，任何2個(gè)序列之間的百分比序列同一性的測定可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。此種數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Myers和Miller(1988)C^5/OS4:11-17的算法；Smith等人(1981)爿Jv.^//.7kfa仇2:482的局部比對算法；Needleman和Wunsch(1970)丄A/o/.萬zo/.48:443-453的全局比又于算法；Pearson和Lipman(1988)尸廠oc.W";7.爿cad85:2444-2448的搜索局部比對法；如Karlin和Altschul(1993)尸roc.廳.^cat/.5"c/.園90:5873-5877中修飾的,Karlin和Altschul(1990)尸rac.淑/.ht/.5"c/.[/&4872264的算法。這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)可以用于比較序列以測定序列同一性。此種實(shí)現(xiàn)包括^旦不限于PC/Gene程序(可從Intelligenetics,MountainView,California獲得)中的CLUSTAL;ALIGN程序(版本2.0)以及GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage,版本10(可/人AccelrysInc.,9685ScrantonRoad，SanDiego,California,USA獲得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的比對可以使用缺省參數(shù)來進(jìn)行。CLUSTAL程序由下述充分描迷Higgins等人(1988)73:237-244(1988);Higgins等人(1989)C觀OS5:151-153;Corpet等人(1988Wwc/e/d油版16:10881-卯；Huang等人(1992)8:155-65;和Pearson等人(1994)她/.腸/.24:307-331。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)同上的算法。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，PAM120權(quán)剩余表(weightresiduetable)、缺口長度罰分12、和缺口罰分4可以與ALIGN程序一起使用。Altschul等人(1990UM/.腸/.215:403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)同上的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分=100、字長=12來進(jìn)行，以獲得與編碼實(shí)施方案的蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核普酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTX程序、得分=50、字長=3來進(jìn)行，以獲得與實(shí)施方案的蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的缺口比對，GappedBLAST(在BLAST2.0中)可以如Altschul等人(1997)M/c/e/c爿c,^"饑25:3389中所述使用?？商娲兀琍SI-BLAST(在BLAST2.0中)可以用于進(jìn)4亍才企測分子間的疏遠(yuǎn)關(guān)系的迭代搜索。參見Altschul等人(1997)同上。當(dāng)利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST時(shí)，可以4吏用各自程序的缺省參數(shù)(例如，BLASTN用于核普酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。比7t還可以通過才企查人工進(jìn)^亍。除非另有說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10使用下述參數(shù)獲得的值關(guān)于核普酸序列的％同一性和％相似性使用缺口權(quán)重50和長度權(quán)重3,以及nwsgapdna.cmp評分矩陣；關(guān)于氨基酸序列的％同一性和％相似性使用缺口權(quán)重8和長度權(quán)重2，以及BLOSUM62評分矩陣；或其任何等價(jià)程序。"等價(jià)程序"意指任何序列比較程序，當(dāng)與由GAP版本10產(chǎn)生的相應(yīng)比對比較時(shí)，對于正一皮討論的任何2個(gè)序列，其產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配的比對，和相同的百分比序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch(1970)Mo/.5w/.48:443-453的算法，以找到使匹配數(shù)目達(dá)到最大和使缺口數(shù)目降到最低的2個(gè)完整序列的比對。GAP考慮了所有可能的比對和缺口位置，且產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少缺口的比對。它允許提供以匹配堿基為單位的缺口產(chǎn)生罰分和缺口延長罰分。GAP必須得益于它插入的每個(gè)缺口的匹配的缺口產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于0的缺口延長罰分，那么對于每個(gè)插入的缺口GAP必須另外得益于缺口長度乘以缺口延長罰分。在GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中關(guān)于蛋白質(zhì)序列的缺省缺口產(chǎn)生罰分值和缺口延長罰分值分別是8和2。對于核苷酸序列，缺省缺口產(chǎn)生罰分是50,而缺省缺口延長罰分是3。缺口產(chǎn)生和缺口延長罰分可以表示為選自0-200的整數(shù)。因此，例如，缺口產(chǎn)生和缺口延長罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。GAP給出最佳比對家族的一個(gè)成員。這個(gè)家族可能存在許多成員，并且沒有其他成員具有更佳的質(zhì)量。GAP顯示用于比對的4個(gè)品質(zhì)因數(shù)質(zhì)量、比、同一性和相似性。質(zhì)量是達(dá)到最大的度量以便比對序列。比是質(zhì)量除以較短片段中的堿基數(shù)目。百分比同一性是實(shí)際上匹配的符號的百分比。百分比相似性是相似的符號的百分比。在缺口對面的符號被忽略。當(dāng)關(guān)于一對符號的評分矩陣值大于或等于相似性閾值0.50時(shí)，評分為相似性。在GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的評分矩陣是BLOSUM62(參見Henikoff和Henikoff(1989)TV"http://.89:10915)。(c)如本文所使用的，當(dāng)經(jīng)過指定比較窗就最大對應(yīng)性比對時(shí)，在2個(gè)多核普酸或多肽序列背景下的"序列同一性"或"同一性"提及2個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性的百分比就蛋白質(zhì)而言使用時(shí)，認(rèn)識(shí)到并不相同的殘基位置通常差別為保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基置換，且因此不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列在保守置換方面不同時(shí)，百分比序列同一性可以向上調(diào)整以校正置換的保守性質(zhì)。差別為此種保守置換的序列被說成具有"序列相似性"或"相似性"。用于進(jìn)行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。一般這涉及將保守置換評分為部分而不是完全匹配，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，當(dāng)相同氨基酸被給予1的得分和非保守置換被給予0的得分時(shí)，保守置換被給予0-1的得分。保守置換的評分例如，如程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView，California)中實(shí)現(xiàn)的進(jìn)行計(jì)算。(d)如本文所使用的，"序列同一性百分比"意指通過經(jīng)過比較窗比較2個(gè)最佳比對的序列測定的值，其中就2個(gè)序列的最佳比對與參考序列(其不包含添加或缺失)比較時(shí)，比較窗中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。百分比通過下述進(jìn)行計(jì)算測定在其上相同的核酸堿基或氨基酸殘基存在于2個(gè)序列中的位置數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中的位置總數(shù)目，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。術(shù)語"多核苷酸"的使用并不意欲使實(shí)施方案限制于包含DNA的多核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。此種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。實(shí)施方案的多核苷酸還包含所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式等。本發(fā)明的分離的多核苷酸可以摻入能夠引入宿主細(xì)胞內(nèi)且在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重組DNA構(gòu)建體內(nèi)。"載體"可以是此種構(gòu)建體，其包括復(fù)制系統(tǒng)以及使多肽編碼序列能夠在給定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列。適合于植物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)基因植物的建立的許多載體已在下述參考文獻(xiàn)中得到描述，例如，Pouwels等人，C/om力gK"o^.'爿Z^oraforyMawwa/,1985,supp.1987;Weissbach和Weissbach,MefAoofe/or尸/"wMo/ecw/a/*說o/ogy，AcademicPress,1989;和Flevin等人,尸/朋/1A/o/ecw/ar說o/ogyMw認(rèn)/,KluwerAcademicPublishers,1990。一般地，植物表達(dá)載體包括例如在5'和3'調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄控制下的一種或多種克隆的植物基因和顯性選擇標(biāo)記。此種植物表達(dá)載體還可以包含啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，控制誘導(dǎo)型或組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞或組織特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄起始開始位點(diǎn)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，RNA加工信號，用于靶向的表達(dá)的信號肽序列，轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，和/或多腺苷酸化信號。術(shù)語"重組構(gòu)建體"、"表達(dá)盒"、"表達(dá)構(gòu)建體"、"嵌合構(gòu)建體"、"構(gòu)建體"、"重組DNA構(gòu)建體"、"DNA構(gòu)建體"和"重組DNA片段"在本文中可互換使用且是核酸片段。重組構(gòu)建體包含核酸片段的人工組合，包括但不限于在自然界中未發(fā)現(xiàn)在一起的調(diào)節(jié)和編碼序列。例如，重組DNA構(gòu)建體可以包含衍生自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或衍和編碼序列。此種構(gòu)建體可以單獨(dú)使用或可以與載體結(jié)合使用。如果使用載體，那么如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，載體的選擇依賴于將用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員充分知道必須存在于載體上的遺傳成分，以便成功地轉(zhuǎn)化、選4^和繁殖包含本發(fā)明的任何一種分離的核酸片段的宿主細(xì)胞。獲得顯示多核苷酸或iV</基因座的所需表達(dá)水平和模式的系的篩選可以通過擴(kuò)增、DNA的DNA印跡分析、mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的免疫印跡分析、表型分析等來完成。術(shù)語"重組DNA構(gòu)建體"指由得自不同來源的核酸片段裝配的DNA構(gòu)建體。核酸片段的類型和起源可以是非常不同的。在一些實(shí)施方案中，進(jìn)一步提供了包含與實(shí)施方案的異源核苷酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體。實(shí)施方案的DNA構(gòu)建體在本文公開的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞、和微生物以及實(shí)踐用于誘導(dǎo)ALS和HPPD抑制劑除草劑抗性的方法中有用。DNA構(gòu)建體將包括與實(shí)施方案的多核苷酸可操作地連接的5'和3'調(diào)節(jié)序列。"可操作地連接"意指2個(gè)或更多元件之間的功能連接。"調(diào)節(jié)序列"指位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、其內(nèi)或下游(3'非編碼序列)，并且可以影響相關(guān)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工、穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸。調(diào)節(jié)序列可以包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、和多腺苷酸化識(shí)別序列。例如，目的多核苷酸和調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)之間的可操作連接是允許目的多核苷酸表達(dá)的功能連接?？刹僮鞯剡B接的元件可以是鄰接的或非鄰接的。當(dāng)用于指2個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)的連接時(shí)，可操作地連接意指編碼區(qū)在相同讀框中。編碼序列可以另外包含用于使蛋白質(zhì)耙向葉綠體、液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞外部的序列。盒可以另外包含待共轉(zhuǎn)化到生物內(nèi)的至少一種另外基因?？商娲兀硗獾囊环N或多種基因可以在多個(gè)DNA構(gòu)建體上提供。此種DNA構(gòu)建體與用于插入多核普酸的多個(gè)限制位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)一起提供，所迷多核苷酸編碼在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的除草劑抗性多肽。DNA構(gòu)建體可以另外包含選擇標(biāo)記基因。DNA構(gòu)建體將以轉(zhuǎn)錄的5'-3'方向包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即，啟動(dòng)子)、翻譯起始區(qū)、實(shí)施方案的多核苷酸、翻譯終止區(qū)和任選地、在宿主生物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。調(diào)節(jié)區(qū)(即，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、和翻譯終止區(qū))和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账峥梢詫τ谒拗骷?xì)胞或?qū)τ诒舜耸翘烊坏?類似的?？商娲?，調(diào)節(jié)區(qū)和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账峥梢詫τ谒拗骷?xì)胞或?qū)τ诒舜耸钱愒吹?。如本文所使用的?異源的"就序列而言是源于外來物種的序列，或如果源于相同物種，通過有意的人為干預(yù)在組合物和/或基因組基因座中由其天然形式進(jìn)行相當(dāng)大修飾。例如，與異源多核苷酸可操作地連接的啟動(dòng)子來自與多核苷酸由其衍生的物種不同的物種，或如果來自相同/類似物種，那么之一或兩者由其原始形式和/或基因組基因座進(jìn)行相當(dāng)大修飾，或啟動(dòng)子不是用于可操作地連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。任選包括的終止區(qū)可以對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是天然的，可以對于可操作地連接的目的多核苷酸是天然的，可以對于植物宿主是天然的，或可以衍生自對于啟動(dòng)子、目的多核苷酸、宿主或其任何組合的另一個(gè)來源(即，外來或異源的)。方便的終止區(qū)可從根癌土壤桿菌(A^me/a"era)的Ti質(zhì)粒獲得，例如章魚堿合酶和胭脂氨酸合酶終止區(qū)。還參見Guerineau等人(1991)Mo/.262:141-144;Proudfoot(1991)Ce〃64:671-674;Sanfacon等人(1991)Ge腦Z)ev.5:141-149;Mogen等人(1990)P/朋/Ce〃2:1261-1272;Munroe等人(1990)Ge"e91:151-158;Ballas等人(1989)A^c/e/c^"Ai^s.17:7891-7903;和Joshi等人(1987)A^c/WcJc/A/^y.15:9627-9639。在具體實(shí)施方案中，使用馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因(PinII)終止子。參見，例如，整體引入本文作為參考的Keil等人(1986)tVwc/.W饑14:5641-5650;和An等人(1989)尸/"WCW/1:115-122。許多啟動(dòng)子可以在實(shí)施方案的實(shí)踐中使用，包括目的多核苦酸序列的天然啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以基于所需結(jié)果進(jìn)行選擇。廣泛范圍的植物啟動(dòng)子在引入本文作為參考的Potenza等人(2004)K/YraCe〃DevBzo/-尸/顯,40.'22的近期綜述中得到討論。例如，核酸可以與組成型、組織優(yōu)選的、病原體誘導(dǎo)型或其他啟動(dòng)子組合用于在植物中表達(dá)。此種組成型啟動(dòng)子包括例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子以及公開于WO99/43838和美國專利號6,072,050中的其他組成型啟動(dòng)子；核心CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等人(1985)A^z^e313:810-812);稻肌動(dòng)蛋白(McElroy等人(1990)尸/a加Ce〃2:163-171);泛蛋白(Christensen等人(1989)尸/諫M/.脂.12:619-632和Christensen等人(1992)尸/a/^M/.腸/.18:675-689);pEMU(Last等人(1991)77z軀Ge威81:581-588);MAS(Velten等人(1984)￡MSC>丄3:2723-2730);ALS啟動(dòng)子(美國專利號5,659,026)等。其他組成型啟動(dòng)子包括例如，美國專利號5,608,149;5,608,144;5,604,121;5，569,597;5,466,785;5,399,680;5,268,463;5,608,142;和6,177，6U。另外的序列修飾已知增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。這些包括編碼偽多腺苷酸化信號的序列、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)、和可能對基因表達(dá)有害的其他此種充分表征的序列的消除。序列的G-C含量可以調(diào)整至對于給定細(xì)胞宿主平均的水平，如通過參考宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因計(jì)算的?？赡軙r(shí)，序列進(jìn)行修飾以避免預(yù)測的發(fā)夾二級mRNA結(jié)構(gòu)。DNA構(gòu)建體可以另外包含5'前導(dǎo)序列。此種前導(dǎo)序列可以用于增強(qiáng)翻譯。翻譯前導(dǎo)區(qū)是本領(lǐng)域已知的且包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)區(qū)，例如EMCV前導(dǎo)區(qū)(腦心肌炎5'非編碼序列)(Elroy-Stein等人(1989)Ato/.爿cadScz'.(7&486:6126-6130);馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)區(qū)，例如TEV前導(dǎo)區(qū)(煙草蝕斑病毒)(GalHe等人(1995)165(2):233-238)，MDMV前導(dǎo)區(qū)(玉米矮花葉病毒)，和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)A^we353:90-94);來自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導(dǎo)區(qū)(Jobling等人(1987)淑歸325:622-625);煙草花葉病毒前導(dǎo)區(qū)(TMV)(Galie等人(1989)inMo/ecw/ar5zo/ogyo/\RA^4，編輯Cech(Liss，NewYork)，第237-256頁)；和玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)區(qū)(MCMV)(Lommel等人(1991)K/ra/ogy81:382-385)。還參見，Della-Cioppa等人(1987)尸/朋/尸/y人"o/.84:965-968。還可以利用已知增強(qiáng)翻if的其他方法，例如內(nèi)含子等。在DNA構(gòu)建體制備中，各種DNA片段可以進(jìn)行處理，以便提供正確方向的，以及適當(dāng)時(shí)在正確的讀框中的DNA序列。為此，辨f^接頭或接頭可以用于連接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位點(diǎn)、多余DNA的去除、限制位點(diǎn)的去除等。為了這個(gè)目的，可以涉及體外誘變、引物修復(fù)、限制、退火、重置換，例如轉(zhuǎn)換和顛換。DNA構(gòu)建體還可以包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些，以及賦予針對除草劑化合物的抗性的基因，所述除草劑化合物例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮、和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。另外的選擇標(biāo)記包括表型標(biāo)記例如p-半乳糖苷酶和熒光蛋白質(zhì)例如綠色熒光蛋白(GFP)(Su等人(2004)歷Wec/mo/Szoe"gS5.'610-9和Fetter等人(2004)尸/朋fCe〃/(5,215-28),青色熒光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)丄Ce/"cz'e臟"7:943-54和Kato等人(2002)尸/a"f尸/z"zo/汲913-42)、和黃色熒光蛋白(來自Evrogen的PhiYFP,參見Bolte等人(2004)/.CW/Sc/e"ce7:943-54)。關(guān)于另外的選擇標(biāo)記，一般參見Yarranton(1992)C紙(9豐5她c/z.3:506-511;Christopherson等人(1992)尸rac.Ato/.爿c^/.WSL489:6314-6318;Yao等人(1992)CW/71:63-72;Reznikoff(1992)Mo/.A//cra6/o/.6:2419-2422;Barkley等人(1980)inT7e(9pero打，pp.177-220;Hu等人(1987)Ce〃48:555-566;Brown等人(1987)Ce〃49:603-612;Figge等人(1988)CW/52:713-722;Deuschle等人(1989)尸roc.淑/.加t/.爿c,.,86:5400-5404;Fuerst等人(1989)尸roc,A^/.爿cadSc/."&486:2549-2553;Deuschle等人(1990)Sc/e"ce248:480-483;Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Reines等人(1993)尸rac.Ato/.S".90:1917-1921;Labow等人(1990)M/.Ce〃.腸/.10:3343-3356;Zambretti等人(1992)Ato/.S".89:3952-3956;Baim等人(1991)WSJ88:5072-5076;Wyborski等人(1991)7W/c/e,c爿"Ai^.19:4647-4653;Hillenand-Wissman(1989)7b;,csA/<9/.5VrwcSz'o/.10:143-162;Degenkolb等人(1991)J"m/cro/>.Jgew/^CAewo//^/:35:1591-1595;Kleinschnidt等人(1988)5z'oc/zew/'Wr少27:1094-1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg;Gossen等人(1992)尸roc.A^/.乂cat/.f/&489:5547-5551;OUva等人(1992)Jw,cra6.々e她C/ze福/^36:913-919;Hlavka等人(1985)//aw必ooA:o/i義/7m'777ew似/尸/zor,co/ogy,第78巻(Springer-Verlag,Berlin);Gill等人(1988)Atowre334:721-724。此種公開內(nèi)容引入本文作為參考。選擇標(biāo)記基因的上迷列表不意欲是限制性的。任何選擇標(biāo)記基因可以用于實(shí)施方案中。實(shí)施方案的基因可以作為轉(zhuǎn)基因進(jìn)行表達(dá)，以制備對als抑制、ppo抑制、色素合成抑制、psii抑制、或合成生長素除草劑類別的至少一種除草劑抗性的植物。使用本公開內(nèi)容中其他地方描述的不同啟動(dòng)子，這將允許其在不同環(huán)境下以調(diào)節(jié)的形式表達(dá)。人們還可以插入完整基因，天然啟動(dòng)子和編碼序列作為轉(zhuǎn)基因。最后，使用實(shí)施方案的基因作為轉(zhuǎn)基因?qū)⒃试S與其他性狀快速組合，例如昆蟲或真菌抗性。在某些實(shí)施方案中，實(shí)施方案的核酸序列可以與目的多核苷酸序列的任何組合堆疊，所述目的多核苷酸序列可以是轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因的，以制備具有所需表型的植物。例如，實(shí)施方案的多核苷酸可以與實(shí)施方案的任何其他多核苷酸堆疊、或與其他基因堆疊。產(chǎn)生的組合還可以包括任何一種目的多核普酸的多個(gè)拷貝。實(shí)施方案的多核苷酸還可以與任何其他基因或基因組合堆疊，以產(chǎn)生具有多種所需性狀組合的植物，包括但不限于對于動(dòng)物祠料所需的性狀例如高油基因(例如，美國專利號6,232,529);平衡氨基酸(例如hordothionins(美國專利號5,990,389;5,885,801;5,885,802;和5,703,409);大麥高賴氨酸(Williamson等人(1987)說力c力em.165:99-106;和WO98/20122);和高甲硫氨酸蛋白質(zhì)(Pedersen等人(1986)丄腸/.C7z復(fù)26h6279;Kirihara等人(198871:359;和Musumura等人(1989)尸/""fiWo/.所o/.12:123));增加的可消化性(例如，經(jīng)修飾的貯存蛋白(于2001年11月7日提交的美國申請系列號10/053,410);和硫氧還蛋白(于2001年12月3日提交的美國申請系列號10/005,429),所述專利的公開內(nèi)容引入本文作為參考。實(shí)施方案的多核苷酸還可以與對于昆蟲、疾病或除草劑抗性所需的性狀堆疊(例如，蘇云金芽孢桿菌(萬"c/〃m//m〃"g/e"jw)毒素蛋白質(zhì)(美國專利號5，366,892;5,747,450;5,737,514;5723,756;5,593,881;Geiser等人(1986)48:109);凌是集素(VanDamme等人(1994)尸/a^A/o/.Szo/.24:825);串珠鐮孢菌素解毒基因(美國專利號5，792,931);無毒性和抗病性基因(Jones等人(1994)Science266:789;Martin等人(1993)Science262:1432;Mmdrinos等人(1994)Cell78:1089);導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體例如S4和/或Hra突變(Lee等人，(1988),/.7(5):1241-1248),對谷氨酰胺合酶抑制劑例如膦絲菌素或草銨膦(basta)的抗性(例如，bar基因；DeBlock等人(1987)￡Affi(9丄6:2513-2518);賦予對HPPD抑制除草劑例如硝草酮或異囌氟草的耐受性的HPPD基因(Matringe等人(2005)尸eWM麵g,WSck騰61:269-276;Dufourmantel等人,(2007)尸/"WBzo^c/z.,/.5:118-133;還參見WO1997049816),關(guān)于針對PPO抑制除草劑的耐受性的基因(Li和Nicholl(2005)尸eWM呵e艦w"".e證61:277-285);合成生長素抗性基因(美國專利申請2005/014737和Herman等人，(2005)J.B/o/.C&w.280:24759-24767)，和草甘膦抗性U/^/w基因，gW基因例如美國專利申請公開US2004/0082770、以及WO02/36782和WO03/092360中公開的那些))；和對于加工或加工產(chǎn)物所需的性狀例如高油(例如，美國專利號6,232,529);經(jīng)修飾的油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國專利號5，952,544;WO94/11516));變性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脫支酶(SDBE));和聚合物或生物塑料(例如，美國專利號5,602,321;卩-酮硫解酶、聚幾基丁酸酯合酶、和乙酰乙酰輔酶A還原酶(Schubert等人(1988)乂v5"c&〃W.170:5837-5847)促進(jìn)聚鞋基鏈烷酸酯(PHAs)的表達(dá))，所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容引入本文作為參考。人們還可以使實(shí)施方案的多核苷酸與提供農(nóng)學(xué)性狀的多核苷酸組合，所述農(nóng)學(xué)性狀例如雄性不育(例如，參見美國專利號5,583,210)、莖強(qiáng)度、開花時(shí)間、產(chǎn)量改善、或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀例如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因靶向(例如WO99/61619;WO00/17364;WO99/25821),所述專利的公開內(nèi)容引入本文作為參考。這些堆疊的組合可以通過任何方法進(jìn)行制備，所述方法包括且不限于通過任何常規(guī)或1^(^(>(^@方法或遺傳轉(zhuǎn)化雜交育種植物。如果性狀通過遺傳轉(zhuǎn)化植物進(jìn)行堆疊，那么目的多核苦酸序列可以在任何時(shí)間且以任何順序進(jìn)行組合。例如，包含一種或多種所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物可以用作耙以通過隨后轉(zhuǎn)化引入進(jìn)一步的性狀。性狀可以在共轉(zhuǎn)化規(guī)程中與由轉(zhuǎn)化盒的任何組合提供的目的多核普酸同時(shí)引入。例如，如果將引入2個(gè)序列，那么2個(gè)序列可以包含在分開的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在相同轉(zhuǎn)化盒上(順式)。序列的表達(dá)可以由相同啟動(dòng)子或由不同啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)。在某些情況下，可能希望引入將抑制目的多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其他抑制盒或超表達(dá)盒的任何組合進(jìn)行組合，以產(chǎn)生在植物中的所需性狀組合。應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到多核苦酸序列可以使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在所需基因組位置上進(jìn)行堆疊。參見，例如W〇99/25821、W099/25854、WO99/25840、W099/25855、和W099/25853,所述所有專利引入本文作為參考。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括可由下述方法獲得的植物使作為第一種親本植抹的包含基因的植物與作為第二種親本植抹的缺乏基因的不同植物雜交，從而獲得包含第一種親本的基因的后代；和任選進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步的育種步驟，以獲得包含笫一種親本的基因的一個(gè)或多個(gè)更多代的后代。此種具體體現(xiàn)的植物可以包括近交和雜種植物。此種植物的種子，包括對于基因是純合和雜合的那些種子，和獲得起因于那些種子加工的植物產(chǎn)物的方法在本發(fā)明中得到體現(xiàn)。在食物或飼料或玉米產(chǎn)物，例如面粉、粗粉和油的生產(chǎn)中使用此種種子也是本發(fā)明的實(shí)施方案。"祖先系"或"祖先"是用作基因來源，例如用于開發(fā)優(yōu)良系的親本系。"后代"是祖先系的后裔，并且可以通過許多代育種與其祖先分開。"優(yōu)良系"或"優(yōu)良變種"是已起因于用于優(yōu)良的農(nóng)學(xué)性能的多個(gè)育種和選擇循環(huán)的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的系或變種。類似地，"優(yōu)良種質(zhì)"是一般衍生自和/或能夠產(chǎn)生具有優(yōu)良的農(nóng)學(xué)性能的植物的農(nóng)學(xué)上優(yōu)良的種質(zhì)，例如現(xiàn)有的或新開發(fā)的玉米或大豆優(yōu)良系。本發(fā)明中還具體體現(xiàn)的是分子標(biāo)記的使用，以使用育種技術(shù)將基因或轉(zhuǎn)基因移入優(yōu)良系內(nèi)。分子標(biāo)記可以用于多種植物育種應(yīng)用中(例如參見Staub等人(1996)//o冶"e固31:729-741;Tanksley(1983)尸/a^Afo/ecw/"r5zo/ogyAe/oWe廣1:3-8)。主要關(guān)心的區(qū)j或之一是4吏用標(biāo)記輔助選擇(MAS)來增加回交和漸滲基因的效率。顯示與影響所需表型性狀的基因座連鎖的分子標(biāo)記提供了用于選擇植物群體中的性狀的有用工具。當(dāng)表型難以測定時(shí)，例如，許多抗病性性狀，或在植物發(fā)育的晚期發(fā)生時(shí)，例如種子特征，這是特別真實(shí)的。因?yàn)镈NA標(biāo)記測定是較不費(fèi)力的，并且占據(jù)比田間表型分型更少的物理空間，所以可以測定大得多的群體，從而增加發(fā)現(xiàn)由供體系移至受體系的具有靶片段的重組體的機(jī)會(huì)。連鎖靠得越近，標(biāo)記就越有用，因?yàn)橹亟M不太可能在標(biāo)記和引起性狀的基因間發(fā)生，所述重組可以導(dǎo)致假陽性。具有側(cè)接標(biāo)記減少假陽性選擇將發(fā)生的機(jī)會(huì)，因?yàn)閷⑿枰p重組事件。理想情況是在基因其自身中具有標(biāo)記，從而使得重組不可能在標(biāo)記和基因間發(fā)生。此種標(biāo)記,皮稱為'完美標(biāo)記，。任選地，實(shí)施方案的核酸可以耙向葉綠體用于表達(dá)。以這種方式，當(dāng)核酸未直接插入葉綠體內(nèi)時(shí)，表達(dá)盒將另外包含編碼轉(zhuǎn)送肽的核酸以使目的基因產(chǎn)物導(dǎo)向葉綠體。此種轉(zhuǎn)送肽是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，VonHeijne等人(1991)尸/"wMo/.歷o/.Ae/.9:104-126;Clark等人(1989)丄腸/.C7^w.264:17544-17550;Della-Cioppa等人(1987)尸/鼎/尸—'o/.84:965-968;Romer等人(1993)腸c/綴腸//z,板Coww節(jié).196:1414-1421;和Shah等人(1986)S"e"ce233:478-481。葉綠體把向序列是本領(lǐng)域已知的，并且包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的葉綠體小亞基(deCastroSilvaFilho等人(1996)A/o/.30:769-780;Schnell等人(1991)./.說o/.C7zew.266(5):3335-3342);5-(烯醇丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)丄說oe"erg.S,omew6.22(6):789-810);色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J.Ao/.C/zew.270(11):6081-6087);質(zhì)體藍(lán)素(Lawrence等人(1997)丄腸/.C/z綴272(33):20357-20363);分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J.說o/.C/zew.268(36):27447-27457);和集光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)丄Szo/.C/zew.263:14996-14999)。還參見VonHeijne等人(1991)尸/耐M/.脂.鄉(xiāng).9:104-126;Clark等人(1989)丄傷o/.C/zem.264:17544-17550;Della-Cioppa等人(1987)尸,a"f尸/^wo/.84:965-968;Romer等人(1993)SZoc/^w.^/o//z>^.Cow"w".196:1414-1421;禾口Shah等人(1986)5Wwce233:478-481。用于轉(zhuǎn)化葉綠體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Svab等人(1990)尸rac.7V"〃.^c"J.OS^87:8526-8530;Svab和Maliga(1993)尸roc.tV"".Jc^/.[/&490:913-917;Svab和Maliga(1993)^"Affi(9丄12:601-606。該方法依賴于包含選才奪標(biāo)記的DNA的基因槍遞送和通過同源重組使DNA靶向質(zhì)體基因組。此外，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過具有沉默質(zhì)體的轉(zhuǎn)基因的反式激活，經(jīng)由核編碼和質(zhì)體指導(dǎo)的RNA聚合酶的組織優(yōu)選的表達(dá)來完成。此種系統(tǒng)已在McBride等人(1994)尸rac.爿cW.Scz'.(7&491'*7301-7305中得到4艮道。待靶向葉綠體的核酸可以就在葉綠體中的表達(dá)進(jìn)行最優(yōu)化，以解決植物核和這種細(xì)胞器之間的密碼子選擇中的差異。以這種方式，目的核酸可以使用葉綠體優(yōu)選的密碼子進(jìn)行合成。參見，例如引入本文作為參考的美國專利號5,380,831。實(shí)施方案的方法可以包括且不限于，將多肽或多核苷酸引入植物內(nèi)。"引入"意指將多核苷酸呈遞給植物。在一些實(shí)施方案中，多核苦酸將以這樣的方式呈遞，從而使得序列接近植物的細(xì)胞的內(nèi)部，包括其可能插入植物的基因組內(nèi)。實(shí)施方案的方法不依賴用于將序列引入植物內(nèi)的具體方法，僅依賴多核苷酸接近植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。用于將多核苷酸引入植物內(nèi)的方法是本領(lǐng)域已知的，包括且不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法、和病毒介導(dǎo)的方法。"轉(zhuǎn)化"指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組內(nèi)，從而導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。包含被轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱為"轉(zhuǎn)基因"生物。"宿主細(xì)胞"指重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化在其中發(fā)生的細(xì)胞，且可以包括酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和植物細(xì)胞。植物轉(zhuǎn)化法的例子包括尤其是土壤桿菌屬(爿gro/^"en'wm)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(DeBlaere等人，1987,A/e仇五"2y附o/./￥丄277)和粒子加速的或"基因槍"轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等人，1987,A^&^(ao"Jow,327:70-73;美國專利號4,945，050)。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"意指引入植物內(nèi)的核苷酸構(gòu)建體整合到植物的基因組內(nèi)，并且能夠由其后代遺傳。"瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，，或"瞬時(shí)表達(dá)"意指引入植物內(nèi)且未整合到植物的基因組內(nèi)的多核苦酸，或引入植物內(nèi)的多肽。轉(zhuǎn)化規(guī)程以及用于將多肽或多核普酸序列51入植物內(nèi)的規(guī)程可以依耙向用于轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物而變。將多肽和多核苷酸引入植物細(xì)胞內(nèi)的合適的方法包括顯微注射(Crossway等人(1986)腸^m々廳4:320-334)、電穿孑"Riggs等人(1986)尸"oc.AA"http://.」cad83:5602-5606、土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利號5，563,055和5,981,840)、直接的基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人(1984)EM8(9丄3:2717-2722)、和沖擊粒子加速(參見,例如，Sanford等人，美國專利號4,945,050;5,879,918;5,886,244;和5,932,782;Tomes等人(1995)in尸/"WCe仏Tly潔，朋JCw//we.'Fwwt/amewto/Afef/zoc/s,編輯Gamborg和Phillips(Springer-Verlag,Berlin);McCabe等人(1988)腸&c/mo/ogy6:923-926);和Lecl轉(zhuǎn)化(WO00/28058)。還參見Weissinger等人(1988)」肌22:421-477;Sanford等人(1987)Wrec/wo/ogy5:27-37(洋蔥)；Christou等人(1988)尸』尸—o/.87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)說o/rec/mo/ogy6:923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)/"Ce〃Dev.AW.27P:175-182(大豆)；Singh等人(1998)T7^o/:jp;/.96:319-324(大豆)；Datta等人(1990)BZo"c/mo/ogy8:736-740(牙舀)；Klein等人(1988)淑/.Jcatl腺85:4305-4309(玉蜀黍);Klein等人(1988)5她c/wo一6:559-563(玉蜀黍);美國專利號5,240,855;5,322,783和5,324,646;Klein等人(1988)尸/""f尸—》/.91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)祝o/ec/z"o/ogy8:833-839(玉蜀黍)；Hooykaas國VanSlogteren等人(1984)AtowreO^m/o"J311:763-764;美國專利號5,736,369(谷物);Bytebier等人(1987)尸亂淑/.Jed固84:5345-5349(百合科(Liliaceae));DeWet等人(1985)inT7zeE;c/7er,wewf"/M3一w/加'owo/0酉/e7Xs^wes,編輯Chapman等人(Longman,NewYork),笫197-209頁(花粉);Kaeppler等人(1990)尸/"WCe〃W，m9:415-418和Kaeppler等人(1992)T7zeoKJ///.84:560-566(頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D'Halluin等人(1992)尸/"WCe〃4:1495-1505(電穿孔);Li等人(1993)尸/^Ce〃i^7^"12:250-255和Christou和Ford(1995)^畫/a75:術(shù)-413(稻);Osjoda等人(1996)A^weB/ofec/wo/ogy14:745-750(經(jīng)由根癌土壤桿菌的玉蜀黍)；所述所有參考文獻(xiàn)引入本文作為參考。用于在植物基因組的特定位置上靶向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核普酸在所需基因組位置上的插入使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)來達(dá)到。參見，例如，W099/25821,W099/25854,WO99/25840,W099/25855和W099/25853,所述所有專利引入本文作為參考。簡言之，實(shí)施方案的多核苷酸可以包含在側(cè)面為非相同重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移盒中。將轉(zhuǎn)移盒引入在其基因組內(nèi)已穩(wěn)定摻入扭位點(diǎn)的植物內(nèi)，所述耙位點(diǎn)側(cè)面為對應(yīng)于轉(zhuǎn)移盒的位點(diǎn)的2個(gè)非相同重組位點(diǎn)。提供了合適的重組酶并且將轉(zhuǎn)移盒整合在靶位點(diǎn)上。目的多核苷酸由此整合在植物基因組中的特定染色體位置上。已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以依據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)成植物。參見，例如McCormick等人(1986)尸/""fCe〃"印o廠"5:81-84。這些植物隨后可以生長、并用相同轉(zhuǎn)化的品系或不同品系授粉，并且鑒定具有所需表型特征的組成型表達(dá)的所得到的后代。可以生長2代或更多代以確保所需表型特征的表達(dá)被穩(wěn)定維持且遺傳，并且隨后收獲種子以確保已達(dá)到所需表型特征的表達(dá)。以這種方式，實(shí)施方案提供了具有穩(wěn)定整合入其基因組內(nèi)的實(shí)施方案的核苷酸構(gòu)建體，例如，實(shí)施方案的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化種子(也稱為"轉(zhuǎn)基因種子")。如本文所使用的，術(shù)語植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、玉蜀黍植物可以由其再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊、和在植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、仁、谷穗、穗軸、外殼、莖、才艮、根尖、花藥等。谷粒意指由商業(yè)栽培者為了除培養(yǎng)或再生物種的目的外生產(chǎn)的成熟種子。再生植物的后代、變體和突變體也包括在實(shí)施方案的范圍內(nèi)，前提是這些部分包含引入的多核苷酸。本發(fā)明的實(shí)施方案可以用于賦予或增強(qiáng)植物，特別是大豆(大豆(G(yc/加w"x刀中的除草劑抗性。其他植物物種在實(shí)踐本發(fā)明的實(shí)施方案中也可以是重要的，包括且不限于其他雙子葉和單子葉農(nóng)作物植物。實(shí)施方案的玉蜀黍基因通常在大多數(shù)商業(yè)玉米系中發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)對至少一種，和通常幾種，合成生長素、ALS-、PSII-和色素合成抑制劑除草劑是天然耐受的，所述除草劑例如玉嘧黃隆、煙嘧黃隆和硝草酮。因此想象存在于大多數(shù)玉米系中針對某些除草劑的相同耐受性可以經(jīng)由轉(zhuǎn)基因方式通過使用內(nèi)源玉蜀黍AV7基因及其變體延伸至其他農(nóng)作物植物。具有對于所選擇的SU除草劑的耐受性或敏感性的玉蜀黍系的列表是可廣泛獲得的，例如由下述提供的那些USDA,ARS，NationalGeneticResourcesProgram.Gerw//a頂ie卵wrces//omm"'o"淑衡A-產(chǎn)G"/iV^.[在線數(shù)據(jù)庫]NationalGermplasmResourcesLaboratory,Beltsville,Maryland.[在2006年3月6日檢索]:由因特網(wǎng)檢索<URL:http:〃www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/dno—eval_acc.pl89201+153002+21〉；和可從BucklerLaboratory網(wǎng)址獲得的"玉蜀黍種質(zhì)系"列表[在2006年3月6日檢索]:由因特網(wǎng)檢索<URL:http:〃www.maizegenetics.net/index.phppage=germplasm/lines.html>，以及參考文章例如Kang(1993)丄fl^e^(y.84(3):216-217中。適當(dāng)時(shí)，多核苷酸可以就在轉(zhuǎn)化的生物中增加的表達(dá)進(jìn)行最優(yōu)化。例如，多核苷酸可以使用植物優(yōu)選的密碼子進(jìn)行合成用于改善的表達(dá)。關(guān)于宿主優(yōu)選的密碼子選擇的討-淪參見，例如，Campbell和Gowri(1990)尸/a^尸/z，,'o/.92:1-11。用于合成植物優(yōu)選基因的方法是本領(lǐng)域可用的。參見，例如引入本文作為參考的美國專利號5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)臉c/"c血油紐17:477-498。本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。感興趣植物的例子包括但不限于玉米(玉蜀黍(Zeamfl>y))、蕓吝屬物種(Sn3%y/casp.)(例如，區(qū)欠洲油菜(wapt^)、完菁(ns/7<2)、芥菜(/w"cea)),苜蓿(#，苜蓿(7Wec//c"go《""v")),稻(稻(6Vyz"《""術(shù)))，黑麥(黑麥(&c"/ecere"/e)),高粱(兩色蜀黍(Sorg/"附Z^co/or)、蜀黍(Sorg/zw附vw/g"re))，粟(例長口,雄卩谷(雄卩谷(尸ewm'犯/wmg/awcww)),考菱(牙夏(尸am'cwmm〃z'acewm)),谷子(谷子(5Wan'a加/Zca)),穆子(糝子(57e萌'"ecorac""")),向曰婆(向曰葵(//e/細(xì)/1/22^)),紅花(紅花(CgtY/謂ws"""o"'ws)),小麥(普通小麥(r"'"c謂腦"v應(yīng)))，大豆(大豆)，煙草(煙草(勵(lì)(2C謹(jǐn))),馬鈴薯(馬鈴薯(5V/aw謂fw6emy應(yīng))),花生(落花生(爿rac/n's/zy/70gae")),沖帛花(;每島才帛(Gc^^//wm6ar6ofcfe/we)、陸；也沖帛(/7//^w/wm)),甘薯(甘薯(/po附oeaZ7"to/w《))，木薯(木薯(A/am力W^cw/e"M)),咖啡(咖啡屬物種(Q#easpp.)),椰子(椰子(Cocos"w"/era)),、菱蘿(疲蘿(Jmmoscomos船)),才甘才禹類才直對為初于(柑桔屬物種(C,力'mspp.)),可可樹(可可樹(r/zeoZwm")),茶(茶(C"we〃/"ww^wv'5))，香蕉(芭蔑屬物種(A/wj"spp.))，魚睪梨(絝梨(尸eAyea(3膨r/ca朋))，無花果(無花果(F/cwsc腦'ca)),番石才留(番石才留(尸57'tZ/wwgwq/"va)),芒果(芒果(Afowgz/ena/w<i/c")),油橄欖(油橄欖(ewo/ae")),番木瓜(番木瓜(G2".capop"")),腰果(腰果(j朋cw力wmoc"tfe"ta/e)),澳洲堅(jiān)果(全緣葉澳洲堅(jiān)果(jVfacat/amfa/Wegn/b/z'g!)),扁斗兆(扁斗兆(尸nmws)),《甘菜(甜菜(5etovw/g",i)),甘蔗(甘蔗屬物種(S"cc/z,mspp.)),燕麥(燕麥屬物種(Jve""spp.))，大麥，棕櫚，椰子，蓖麻子，橄欖，豆類(例如瓜爾豆、刺槐豆、胡,巴、大豆、四季豆、綠豆、利馬豆、蠶豆)，豌豆(例如，豇豆、紫花豌豆、小扁豆、鷹嘴豆等)，蔬菜，觀賞植物和針葉樹。對于本發(fā)明重要的其他植物包括具有用作生物燃料農(nóng)作物潛能的那些，包括但不限于大網(wǎng)茅草例如柳枝稷(柳枝稷(尸"wcwww>g^ww))，象草(象草(尸e;wwefwm/7w777wewm)),石茅高梁(石茅高粱(Sorg/mm/za/印ewe))，芒屬物種(A^yc"W/zz^spp.),以及雜交楊樹和雜交柳沖對。蔬菜包括番癡(番^S(丄少co/ers7'co/7escw/eWwm)),葛苣(例如,萵苣(丄a"wcara"'va)),青豆(菜豆(尸/7"mo/船vw/gan'51)),利馬豆(利馬豆(尸/"seo/ws//me"ws)),3宛豆(山黧豆屬物種(丄a^yrwsspp.)),和香瓜屬(Oicw脂s)的成員例如黃瓜(黃瓜(C.saf!'vws))、羅馬甜瓜(羅馬甜瓜(C.ca打m/wpe朋^))、甜瓜(甜瓜(C.me/o))。觀賞植物包括杜鵑花(杜鵑花屬物種(^KKfo&mira"spp.))、八仙花(八仙花(M3cT0;7一/a/^rawgea))、芙蓉(朱植(///Zh、ci^1))、攻瑰(薔薇屬物種(spp.))、郁金香(郁金香屬物種(7W^7"w/.))、水仙花(水仙屬物種(A^rc/^msspp.))、矮牽牛(碧冬茄(尸"wma/^〃'c/a))、康乃馨(麝香石竹(Z)/a"f/zw51ca，/一/ws))、一品紅(一品紅(五w//zon^'a/9w/cAem',))、和菊花。實(shí)施方案不僅提供了用于在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中使用的基因，還提供了允許抗性基因用作玉米育種策略中的標(biāo)記的序列和方法。例如，實(shí)施方案的基因，或包含其的基因座可以在預(yù)期用于育種的農(nóng)作物系中進(jìn)行鑒定。當(dāng)通常存在天然耐受性時(shí)，育種者一般希望避免使用對除草劑敏感的農(nóng)作物系。因此，A^7基因序列的鑒定將幫助育種者鑒定和避免產(chǎn)生除草劑敏感系。基于核酸的標(biāo)記可以使用許多不同的技術(shù)進(jìn)行開發(fā)和應(yīng)用。此種技術(shù)包括且不限于限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、單序列重復(fù)(SSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)、分裂擴(kuò)增多態(tài)序列(CAPS)(Rafalski和Tmgey,1993,TrendsinGenetics9:275-280)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)(Vos等人，995，NucleicAcdsRes.23:4407-4414)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)(Brookes,1999,Gene234:177-186)、序列表征擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)(Paran和Michdmore,1993，Theor.Appl.Genet.85:985-993)、標(biāo)志序列位點(diǎn)(STS)(Onozaki等人，2004,E叩hytica138:255-262)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)(Orita等人,1989，ProcNatlAcadSciUSA86:2766—2770)、簡單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)(Blair等人，1999，Theor.Appl.Genet.98:780-792)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間擴(kuò)增多態(tài)性(IRAP)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(REMAP)(Kalendar等人(1999)Theor.Appl.Genet98:704-711)等。如本文所使用的，"基因座"應(yīng)指攜帶基因，或可能攜帶2種或更多基因的染色體的遺傳限定區(qū)域，所述基因如此緊密連鎖從而使得它們在遺傳上表現(xiàn)為負(fù)責(zé)表型的單個(gè)基因座。"基因"應(yīng)指那個(gè)基因座內(nèi)的特定基因，包括其相關(guān)的調(diào)節(jié)序列。因此，A^//基因座指在遺傳上定義為賦予針對ALS抑制、PPO抑制、色素合成抑制、PSII抑制、和合成生長素除草劑類別的至少一種除草劑的抗性的染色體區(qū)域。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是A^//基因的分離和證實(shí)它是負(fù)責(zé)由基因座的存在賦予的表型的基因。遺傳上定義的基因座其性質(zhì)在尺寸方面不如可以分子描述的基因那樣精確定義。單位、前綴和符號可以以其SI公認(rèn)形式表示。除非另有說明，分別地，核酸以5'至3'方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書寫。數(shù)字范圍包括限定范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可以以其通常已知的3字母符號或由IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission推薦的單字母符號提及。同樣地，核苷酸可以由其通常公認(rèn)的單字母編碼提及。上文限定的術(shù)語就整體而言通過參考說明書更充分地限定。實(shí)施例本發(fā)明的實(shí)施方案在下述實(shí)施例中進(jìn)一步限定，其中除非另有說明，所有份和百分比都按重量計(jì)，且度是攝氏的。應(yīng)當(dāng)理解這些實(shí)施例在指出本發(fā)明的實(shí)施方案的同時(shí)，僅為了舉例說明而給出。根據(jù)上文討i侖和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域沖支術(shù)人員可以確定本發(fā)明的實(shí)施方案的基本特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可以制備各種改變和修飾以使其適應(yīng)各種使用和條件。因此，除了本文顯示和描述的那些外，本發(fā)明實(shí)施方案的各種修飾由于前述說明書對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。此種修飾還意欲包含在附加權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文所述的每個(gè)參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容整體引入作為參考。實(shí)施例1通過定位克隆鑒定A^/y基因BC1群體(預(yù)期50%A^/7/w//,50%"、s/7/>w/7,使用敏感的近交W703A作為回歸親本，和B73或Q66作為抗性系來開發(fā)。植物在約V3階段時(shí)用2.3mM煙嘧黃隆、0.5%v/vKinetic表面活性劑溶液進(jìn)行噴霧?？剐院兔舾行杂H本也與對照一樣進(jìn)行生長和噴霧。為了避免錯(cuò)誤分類可能由于除除草劑應(yīng)用外的原因死亡的植物，僅取樣和分析抗性后代?？偣?6個(gè)抗性植物用于初始作圖。這足以將tV#7置于標(biāo)記umcl766和umc2036之間，并且因此在基于玉蜀黍B73的物理圖譜的重疊群202上((在2006年3月6日檢索)從因特網(wǎng)檢索〈URL:http:〃www.gramene.org/Zea—mays/cytoviewcontig=ctg202&x=44&y=9>)。在基于玉蜀黍Mo17的重疊群的BAC末端序列的基礎(chǔ)上，側(cè)接CAPS(分裂擴(kuò)增多態(tài)序列)標(biāo)記在重疊群202的BACs上進(jìn)行鑒定。對于這個(gè)間隔的精細(xì)作圖，在下一個(gè)步驟中使用總共388個(gè)抗性植物?；谶@個(gè)間隔中的BACs的亞克隆片,爻的測序，在重疊BACs上發(fā)現(xiàn)2個(gè)側(cè)接CAPs標(biāo)記。這2種標(biāo)記都具有2/388個(gè)重組體。這2個(gè)BACs進(jìn)行測序和分析。在側(cè)面為2個(gè)有專利權(quán)的標(biāo)記P1和P2的2個(gè)BACs的163kb區(qū)域內(nèi)，存在幾個(gè)推定基因。對于第3輪作圖，使用總共2584個(gè)抗性植物，并且開發(fā)標(biāo)記以分離一些基因。一個(gè)標(biāo)記顯示11/2584(0.4%)個(gè)重組體，從而幫助消除負(fù)責(zé)抗性的某些基因。2個(gè)其他標(biāo)記各自具有2(0.08%)個(gè)重組體，從而消除另一個(gè)基因。最后，2個(gè)基因間的標(biāo)記具有單個(gè)重組體(0.04%),從而消除那2個(gè)基因之一。因此確定哪個(gè)基因是目的基因。測定基因A^/7與本領(lǐng)域已知的一些細(xì)胞色素P450基因具有同源性。實(shí)施例2A^/7基因的分析在B73衍生的BAC中的基因18(A^/7)序列的分析顯示521個(gè)氨基酸的可讀框，并且包含在所有細(xì)胞色素P450s中發(fā)現(xiàn)的保守的血紅素結(jié)合基序FXXGXXXCXG(SEQIDNO:14)(圖Id和2b)。為了確定等位基因在玉蜀黍系中是否是一致的，測試對煙嘧黃隆具有未知敏感性水平的3個(gè)玉米系，以測定它們的反應(yīng)且隨后評估它們的序列。植物在約V3階段時(shí)用2.3mM煙嘧黃隆、0.5%v/vKinetic表面活性劑溶液進(jìn)行噴霧。已知抗性和壽丈感系也與對照一樣進(jìn)行生長和噴霧。3個(gè)系的測試結(jié)果顯示系Q66和BlackMexicanSweet(BMS)是抗性的，且系A(chǔ)188是敏感的。在2個(gè)其他抗性系Q66和BMS中也具有這個(gè)ORF,盡管Q66與B73和BMS相差3個(gè)氨基酸(圖2a和2b)。這3個(gè)變體氨基酸在圖2a和2b中在Q66序列串中用粗體和矩形進(jìn)行標(biāo)記以顯示其位置。每文感系GA209的分析顯示相對于抗性系的392bp插入，其導(dǎo)致移碼和僅338個(gè)氨基酸的可讀框(圖2b)。眾多北美敏感系的調(diào)查顯示許多敏感系包含這個(gè)相同的未知DNA插入。來自F2敏感系的序列分析顯示在B73(SEQIDNO:2)和F2(SEQIDNO:22)之間僅存在一個(gè)核苷酸差異，這使氨基酸263從精氨酸變成蘇氨酸(圖2b)。這個(gè)單一變化因此消除了抗性表型，并且具有此種變化的變體序列預(yù)期不保留生物活性。這個(gè)變化在開發(fā)SNP中是有用的，以幫助玉米育種者避免易感等位基因。7^/7與近期已報(bào)道控制那種植物中的磺酰脲敏感性的稻細(xì)胞色素P450(登記號:ABC69856,SEQIDNO:4)67%相同。來自B73的基因組序列顯示具有預(yù)期的GT左邊界和AG右邊界的單個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子的位置顯示于序列表的SEQIDNO:16中。這種基因的克隆具有許多潛在應(yīng)用。它可以用作選擇標(biāo)記用于在敏感可轉(zhuǎn)化系例如A188中轉(zhuǎn)化(Ishida等人，(1996)A^fwre5/ofec/mo/og>M4:745-750)。設(shè)計(jì)為抑制基因功能的轉(zhuǎn)基因?qū)⒊洚?dāng)顯性失活選擇標(biāo)記。還可以用于在其他植物例如大豆中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因抗性，所述其他植物對磺酰脲的這個(gè)亞類敏感。實(shí)施例3:關(guān)于玉蜀黍植物對煙嘧黃隆的敏感,性的測試測試對煙嘧黃隆具有未知每文感性水平的3個(gè)玉米系以測定其反應(yīng)。植物在約V3階—敬時(shí)用2.3mM煙嘧黃隆、0.5%v/vKinetic表面活性劑溶液進(jìn)行噴霧。已知抗性和敏感系也與對照一樣進(jìn)行生長和噴霧。3個(gè)系的測試結(jié)果顯示系Q66和BMS是抗性的，且系A(chǔ)188是敏感的。實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因大豆植物的制備下述母液和培養(yǎng)基用于大豆植物的轉(zhuǎn)化和再生母液石危酸鹽100X原液37.0gMgS04.7H2〇，1.69gMnS04.H20,0.86gZnS04.7H20,0.0025gCuS04.5H20.卣化物100X原液30.0gCaCl2.2H2〇，0.083gKI，0.0025gCoCl2.6H20,P、B、Mo100X原液18.5gKH2P04,0.62gH3B03,0.025gNa2Mo04.2H20FeEDTAIOOX原液3.724gNa2EDTA,2.784gFeS04.7H20.2,4-D原液10mg/mL。維生素B5IOOOX原液10.0g肌醇，0.10g煙酸，0.10g吡哆醇HC1,1g硫胺素。培養(yǎng)基(每升)SB196:lOmL各種上述母液，1mLB5維生素原液，0.463g(NH4)2S04,2.83gKN03，lmL2,4-D原液，1g天冬酰胺，lOg蔗糖，pH5.7。SB103:1pk。Murashige&Skoog鹽混合物，1mLB5維生素原液，750mgMgCl2六水合物，60g麥芽糖，2g脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite),pH5.7。SB166:補(bǔ)加有5g/L活性炭的SB103。SB71-4:Gamborg'sB5鹽(Gibco-BRL目錄號21153-028)，1mLB5維生素原液，30g蔗糖，5gTC瓊月旨，pH5.7。將大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)于28。C維持在旋轉(zhuǎn)振蕩器(150rpm)上在35mL液體培養(yǎng)基(SB196)中，使用提供16小時(shí)日/8小時(shí)夜循環(huán)的熒光燈。培養(yǎng)物通過將約35mg組織接種到35mL新鮮液體培養(yǎng)基內(nèi)每2周進(jìn)行傳代培養(yǎng)。大豆胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)使用DuPontBiolisticPDS1000/He儀器通過基因槍轟擊進(jìn)行轉(zhuǎn)化(參見Klein等人(1987)iVafwre327:70-73)。用于表達(dá)的重組DNA質(zhì)粒在與選擇標(biāo)記基因分開的重組DNA質(zhì)粒上。將2種重組DNA質(zhì)粒如下共沉淀到金顆粒上。將懸浮液中的DNAs加入50pL20-60mg/mL0.6|imi金顆粒懸浮液中，且隨后與50CaCl2(2.5M)和20亞精胺(0.1M)組合。將混合物脈沖渦旋5次，在微量離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)10秒，且取出上清液。DNA包被的顆粒隨后用150100%乙醇洗滌1次，脈沖渦旋并在孩i量離心機(jī)中再次旋轉(zhuǎn)，且重懸浮于85pL無水乙醇中。隨后將5^LDNA包被的金顆粒裝載到每個(gè)巨載體盤上。將約150-250mg2周的懸浮培養(yǎng)物置于60mmx15mm空的培養(yǎng)板中，并且殘留液體4吏用移液管從組織中取出。組織放置距離阻滯篩約3.5英寸并且每個(gè)組織板轟擊1次。破膜壓設(shè)為650psi并且室抽空為-28英寸Hg。轟擊18個(gè)板，并且在轟擊后，來自每個(gè)板的組織分成2個(gè)瓶，放回到液體培養(yǎng)基內(nèi)，并且如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊后7天，將液體培養(yǎng)基更換成補(bǔ)加有50mg/mL潮霉素的新鮮SB196培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基每周或每2周進(jìn)行更新。轟擊后7周，觀察到由未轉(zhuǎn)化的、壞死胚發(fā)生簇中生長出綠色的、轉(zhuǎn)化的組織。分離的綠色組織被取出且接種到個(gè)別瓶內(nèi)以產(chǎn)生新的、克隆繁殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物。因此，每個(gè)新系作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行處理。浮液進(jìn)行維持，或通過個(gè)別體細(xì)胞胚的成熟和發(fā)芽再生成完整植物。將轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生簇從液體培養(yǎng)物中取出并且置于不包含激素或抗生素的固體瓊脂培養(yǎng)基(SB166)上1周。胚于26。C使用混合的熒光和白熾燈以16小時(shí)日8小時(shí)夜的時(shí)間表進(jìn)行培養(yǎng)。1周后，隨后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至SB103培養(yǎng)基且維持在相同生長條件下另外3周。在由液體培養(yǎng)轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基前，來自所選擇的系的組織通過PCR就嵌合基因的存在進(jìn)行測定。體細(xì)胞胚在4周后變得適合于發(fā)芽，并且隨后從成熟培養(yǎng)基中取出且在空的培養(yǎng)皿中千燥1-5天。然后將干燥的胚種植在SB71-4培養(yǎng)基中，且允許在上文所述的相同光和發(fā)芽條件下發(fā)芽。將發(fā)芽的胚轉(zhuǎn)移至無菌土壤且生長至成熟。實(shí)施例5TO和Tl轉(zhuǎn)基因植物分析row/試制備包含A^/7基因的2種不同構(gòu)建體，以檢查當(dāng)轉(zhuǎn)化到大豆內(nèi)時(shí)基因的除草劑功效。7^/7構(gòu)建體與35S:HYG插入片段一起進(jìn)行共轟擊，以允許使用潮霉素的事件選擇。在V2-V6生長階段時(shí)，總共127個(gè)TO植物用35g/ha玉嘧黃隆進(jìn)行噴霧。所有玉嘧黃隆處理與0.2。/。w/w非離子型表面活性劑一起在287L/ha的噴霧體積中應(yīng)用。除了TO植物外，包括3種不同的對照的重復(fù)-2種陽性和1種陰性。個(gè)別植物在處理后IO天時(shí)就除草劑應(yīng)答進(jìn)行評估，并且指定1-9的目測應(yīng)答得分(1=死亡植物至9=未觀察到作用)。基于對起始玉嘧黃隆噴霧的高耐受性得分，5個(gè)T0事件用另外35g/ha玉嘧黃隆進(jìn)行噴霧。植物在第二次應(yīng)用后IO天時(shí)就目測耐受性使用1-9的得分進(jìn)行評定。在TO代中，在用35g/ha玉嘧黃隆處理后10天時(shí)，與對照比4交51個(gè)事件中的4個(gè)具有改善的耐受性。在35g/ha玉嘧黃隆的另外應(yīng)用后，51個(gè)TO事件中的3個(gè)具有改善的耐受性水平。這51個(gè)事件中的2個(gè)進(jìn)展至Tl代用于更廣泛的除草劑測試。77豸試來自TO代的2個(gè)事件進(jìn)展至Tl代用于基因的另外除草劑功效測試。2種對照的重復(fù)以及Tl植物生長在溫室實(shí)-驗(yàn)中，且在V3生長階段時(shí)用以2種速率之一(200g/ha或50g/ha)的硝草酮、煙嘧黃隆(70g/ha)或玉嘧黃隆(35g/ha)進(jìn)行噴霧。所有除草劑處理與1%w/w經(jīng)修飾的種子油佐劑一起以374L/ha的噴霧體積進(jìn)行應(yīng)用。如在TO測試中使用的一樣，植物在應(yīng)用后8天時(shí)使用1-9的得分就除草劑應(yīng)答進(jìn)行評定。擴(kuò)展的除草劑功效測試在第二次Tl植物實(shí)驗(yàn)中發(fā)展用于由TO代進(jìn)展的相同的2個(gè)事件。在V3生長階段時(shí)，植物用不同的除草劑處理進(jìn)行噴霧，所迷除草劑當(dāng)以檢查的速率應(yīng)用于商品大豆時(shí)，一般將引起相當(dāng)大的農(nóng)作物損傷。所有除草劑處理以287L/ha的噴霧體積進(jìn)行應(yīng)用。異嗯氟草U40g/ha)、苯吡唑草酮(140g/ha)、和磺草酮(140g/ha)與1%w/w經(jīng)修飾的種子油佐劑一起應(yīng)用。敵草隆處理(560g/ha)與1。/。w/w石油農(nóng)作物油佐劑一起應(yīng)用。三氟羧草醚(4480g/ha)、磺胺草唑(140g/ha)、氟鵬嗪酮(140g/ha)、和麥草畏(280g/ha)與0.25%w/w非離子型表面活性劑一起應(yīng)用。玉嘧黃隆(35g/ha)處理與0.5。/ow/w堿性摻合佐劑一起應(yīng)用。在處理后8和15天時(shí)，植物使用0-100的等級(0=無損傷至100=死亡植物)就農(nóng)作物損傷進(jìn)行目測評定。因?yàn)門1事件被隔離，僅選擇具有最佳總體得分的植物，其對應(yīng)于預(yù)期將具有轉(zhuǎn)基因的75%。在三氟羧草醚、麥草畏、敵草隆、氟嗯嗪酮、異嗯氟草、硝草酮、玉嘧黃隆、石黃草酮、石黃胺草唑、和苯吡唑草酮處理應(yīng)用后8DAT和15DAT時(shí)，與對照比較，2個(gè)事件之一具有明顯更佳的耐受性。在三氟羧草醚、麥草畏、異嗯氟草、硝草酮、玉嘧黃隆、磺草酮、磺胺草唑、和苯吡唑草酮處理應(yīng)用后15DAT時(shí)，與對照比較，笫二個(gè)事件具有明顯更佳的耐受性。盡管在測試事件中的基因的確切表達(dá)水平未測定，但當(dāng)與對照植物直接比較時(shí)，包含玉蜀黍基因的轉(zhuǎn)基因大豆植物顯示出針對一系列不同除草劑更佳的耐受性。權(quán)利要求1.一種分離的多核苷酸，其包含(a)編碼能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性的多肽的核苷酸序列，其中所述除草劑是選自下述的除草劑類別的成員(i)ALS抑制類別；(ii)色素合成抑制類別；(iii)PPO抑制類別；(iv)PSII抑制類別；和(v)合成生長素類別其中當(dāng)基于Needleman-Wunsch比對算法與SEQIDNO1比較時(shí)，所述多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列，或(b)所述核苷酸序列的互補(bǔ)體，其中所述互補(bǔ)體和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100％互補(bǔ)的。2.權(quán)利要求1的分離的多核苦酸，其中所述多肽能夠賦予針對至少2種除草劑的抗性，其中每種除草劑是選自下述的不同除草劑類別的成員(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別。3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述多肽能夠賦予針對至少3種除草劑的抗性，其中每種除草劑是選自下述的不同除草劑類別的成員(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII氺卩制類另'J;禾口(e)合成生長素類別。4.權(quán)利要求l的分離的多核苷酸，其中所述多肽能夠賦予針對至少4種除草劑的抗性，其中每種除草劑是選自下述的不同除草劑類別的成員(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別。5.權(quán)利要求l的分離的多核苷酸，其中所述多肽能夠賦予針對至少5種除草劑的抗性，其中每種除草劑是選自下述的不同除草劑類別的成員.-(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別。6.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中基于Needleman-Wunsch比對算法，所述多肽的所述氨基酸序列和SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%的同一性。7.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中基于Needleman-Wunsch比對算法，所述多肽的所述氨基酸序列和SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少95%的同一性。8.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所迷核芬酸序列包含SEQIDNO:1。9.一種載體，其包含權(quán)利要求1的多核苦酸。10.—種重組DNA構(gòu)建體，其包含與至少一種調(diào)節(jié)序列可操作地連接的權(quán)利要求1的多核苷酸。11.一種用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法，其包括用權(quán)利要求1的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。12.—種植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體。13.—種用于生產(chǎn)植物的方法，其包括用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且由所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物。14.一種植物，其包含權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體。15.—種種子，其包含權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體。16.權(quán)利要求14的植物，其中所述植物是單子葉植物。17.權(quán)利要求16的植物，其中所述雙子葉植物選自玉蜀黍、小麥、大麥、燕麥、柳枝稷、高粱和稻。18.權(quán)利要求14的植物，其中所述植物是雙子葉植物。19.權(quán)利要求18的植物，其中所述雙子葉植物選自大豆、低芥酸菜子、馬鈴薯、棉花和向日葵。20.權(quán)利要求14的植物，其中所述植物進(jìn)一步包含第二種除草劑抗性基因。21.權(quán)利要求14的植物，其中所述植物進(jìn)一步包含編碼具有草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的基因。22.權(quán)利要求21的植物，其中所述植物進(jìn)一步包含編碼賦予針對ALS抑制劑的耐受性的多肽的第二種除草劑抗性基因。23.權(quán)利要求14的植物，其中所述植物進(jìn)一步包含編碼殺蟲劑多肽的基因。24.—種具有針對至少一種除草劑增強(qiáng)的耐受性的植物，其包含權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其中所述植物進(jìn)一步包含第二種除草劑抗性基因，其提供針對選自除草劑類別的除草劑的一定水平的耐受性，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；其中權(quán)利要求10的重組構(gòu)建體對所述植物賦予的針對所述除草劑的耐受性水平高于由包含所述第二種除草劑抗性基因但不包含權(quán)利要求10的重組構(gòu)建體的植物顯示的耐受性水平。25.—種賦予或增強(qiáng)針對至少一種除草劑的抗性的方法，其中所述除草劑選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；其包括用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，由此賦予或增強(qiáng)針對所述至少一種除草劑的抗性。26.—種賦予或增強(qiáng)針對至少2種除草劑的抗性的方法，其中每種除草劑選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；其包括用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，由此賦予或增強(qiáng)針對所迷至少2種除草劑的抗性。27.—種賦予或增強(qiáng)針對至少3種除草劑的抗性的方法，其中每種除草劑選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；其包括用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，由此賦予或增強(qiáng)針對所迷至少3種除草劑的抗性。28.—種賦予或增強(qiáng)針對至少4種除草劑的抗性的方法，其中每種除草劑選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；其包括用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，由此賦予或增強(qiáng)針對所迷至少4種除草劑的抗性。29.—種賦予或增強(qiáng)針對至少5種除草劑的抗性的方法，其中每種除草劑選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(a)ALS抑制類別；(b)色素合成抑制類別；(c)PPO抑制類別；(d)PSII抑制類別；和(e)合成生長素類別；其包括用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化才直物，由此賦予或增強(qiáng)針對所述至少5種除草劑的抗性。30.—種改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少一種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括.-(a)用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對所述至少一種除草劑的抗性；其中所述至少一種除草劑選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(i)ALS抑制類別；(n)色素合成抑制類別；(in)PPO抑制類別；(iv)PSII抑制類別；和(v)合成生長素類別。31.—種改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少2種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括(a)用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對所述至少2種除草劑的抗性；其中所述至少2種除草劑各自選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(i)ALS抑制類別；(ii)色素合成抑制類別；(in)PPO抑制類別；(iv)PSII承卩制類另'J;和(V)合成生長素類別。32.—種改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少3種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括(a)用權(quán)利要求IO的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對所述至少3種除草劑的抗性；其中所述至少3種除草劑各自選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(i)ALS抑制類別；(ii)色素合成抑制類別；(iii)PPO抑制類別；(iv)PSII抑制類別；和(v)合成生長素類別。33.—種改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少4種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括(a)用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對所述至少4種除草劑的抗性；其中所述至少4種除草劑各自選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(i)ALS抑制類別；(ii)色素合成抑制類別；(iii)PPO抑制類別；(iv)PSII抑制類別；和(v)合成生長素類別。34.—種改變植物細(xì)胞中能夠賦予針對至少5種除草劑的抗性的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的方法，其包括(a)用權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(b)使所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在適合于表達(dá)所述重組DNA構(gòu)建體的條件下生長，其中所述重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致所述轉(zhuǎn)化的宿主中產(chǎn)生改變水平的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)能夠賦予針對所述至少5種除草劑的抗性；其中所述至少5種除草劑各自選自除草劑類別，所述除草劑類別選自(i)ALS抑制類別；(ii)色素合成抑制類別；(iii)PPO抑制類別；(iv)PSII抑制類別；和(v)合成生長素類別。35.權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述除草劑選自除草劑的ALS抑制類別且選自下述(a)煙嘧黃??；(b)玉嘧黃??；(c)氟嘧黃??；(d)咪草煙；(e)綠黃?。?f)氯嘧黃??；(g)醚苯黃??；(h)氟唑啶草；和(i)滅草喹。36.權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述除草劑選自除草劑的色素合成抑制類別且選自下述(a)異嗯氟草；(b)苯吡唑草酮；(c)磺草酮；和(d)tembotrione。37.權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述除草劑選自除草劑的PPO抑制類別且選自下述(a)三氟羧草醚；(b)flumioxan;和(C)磺胺草唑。38.權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的方法，其中所迷除草劑選自除草劑的PSII抑制類別且選自下述(a)敵草??；(b)利谷??；(c)苯達(dá)松；和(d)綠麥隆。39.權(quán)利要求25-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述除草劑是麥草畏。40.—種測定植物中權(quán)利要求1的多核苷酸的存在的方法，其包含下迷的至少一種(a)從所述植物中分離核酸分子，且通過嘗試擴(kuò)增與權(quán)利要求1的多核苷酸同源的序列測定i^/7基因是否存在，或(b)從所述植物中分離核酸分子，且進(jìn)4亍DNA或RNA雜交，或(c)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSF1蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)4亍蛋白質(zhì)印跡，或(d)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSF1蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行ELISA測定，由此測定所述植物中權(quán)利要求1的多核普酸的存在。41.一種測定植物中基因座的存在的方法，其包含下述的至少一種(a)從所述植物中分離核酸分子，且通過嘗試擴(kuò)增與權(quán)利要求1的多核普酸同源的序列測定A^/7基因是否存在，或(b)從所述植物中分離核酸分子，且進(jìn)行DNA或RNA雜交，或(c)從所述植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSF1蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，或(d)從所迷植物中分離蛋白質(zhì)，且使用針對NSF1蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行ELISA測定，由此測定所述植物中A^/7基因座的存在。42.—種包含權(quán)利要求1的多核苷酸的大豆植物，其中所述大豆植物還顯示出大豆胞嚢線蟲抗性，其中所述多核苷酸已通過轉(zhuǎn)化或植物育種技術(shù)整合入，且其中所述大豆植物已由選自下述的種質(zhì)進(jìn)行育種(a)Peking;(b)PI88788;(c)PI89772;(d)PI術(shù)63;(e)PI209332;(f)PI404189A;(g)PI437654;(h)PI438489B;(i)PI467312;(j)PI468916;(k)Hartwig;(1)J87-233;和(m)衍生自來源(a)-(1)的后代。全文摘要本發(fā)明涉及編碼可以賦予針對至少一種除草劑的抗性的基因的多核苷酸序列。它進(jìn)一步涉及攜帶包含所述多核苷酸序列的嵌合基因的植物和植物種子，所述多核苷酸序列增強(qiáng)或賦予針對至少一種除草劑的抗性，以及制備所述植物和種子的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了可以用作分子標(biāo)記的序列，其依次可以用于鑒定玉米系中起因于新雜交的目的區(qū)域，并且通過避免敏感系快速且有效地選擇最佳系用于育種策略。文檔編號C07K14/415GK101437844SQ200780016566公開日2009年5月20日申請日期2007年3月9日優(yōu)先權(quán)日2006年3月9日發(fā)明者A·D·小圭達(dá),B·李,C·B·哈策爾,M·E·威廉斯,T·丹申請人:納幕爾杜邦公司