一株枯草芽孢桿菌及包含該菌株的飼料添加劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及功能微生物篩選技術領域，具體設及一株枯草芽抱桿菌及包含該菌株 的飼料添加劑。
【背景技術】
[0002] 隨著水產品需求量的增加及水產品貿易的國際化發(fā)展，水產養(yǎng)殖業(yè)近年來發(fā)展突 飛猛進。但是，水產養(yǎng)殖的集約化和高密度規(guī)模日益擴大，養(yǎng)殖環(huán)境的惡化和疾病的危害給 水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。傳統防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用 易產生耐藥性菌株問題，并且存在水產動物體內殘留的問題，因此尋找抗生素替代品成為 必然。
[0003] 益生菌能夠參與動物體內微生物平衡，直接通過增強動物對腸內有害微生物群落 的抑制作用，或通過增強非特異性免疫功能來預防疾病，進而間接起到促進動物生長的作 用，提高動物飼料的轉化率。因此，近些年對于益生菌的篩選成為本領域內的研究熱點，也 對水產飼料配方的改進具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株新型枯草芽抱桿菌及包含該菌株的水產飼料添加劑。所 述枯草芽抱桿菌度acillussubtillis)篩選自南美白對郵養(yǎng)殖池，能夠有效抑制病原菌， 提高水產動物的免疫力和抗病力，促進水產動物生長，應用前景廣泛。
[0005] 本發(fā)明一方面提供了一株枯草芽抱桿菌SY12度acillussubtillisSY12)，已 于2015年8月10日保藏于中國武漢武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，其保藏編號為 CCTCCNO:12015483ο
[0006] 本發(fā)明另一方面提供了包含上述枯草芽抱桿菌的飼料添加劑。
[0007] 所述飼料添加劑還包括多糖、維生素、中草藥、酶或乳化劑中的一種或多種的組 么 η〇
[0008] 本發(fā)明還提供了上述枯草芽抱桿菌在水產養(yǎng)殖中的應用。 陽009] 本發(fā)明的有益效果：
[0010] 本發(fā)明篩選到的枯草芽抱桿菌SY12,能有效抑制哈維弧菌和媛弧菌等病原菌，提 高養(yǎng)殖動物的免疫力，減少病害的發(fā)生，同時該菌株產蛋白酶和淀粉酶的能力均較強，可作 為飼料添加劑，顯著提高養(yǎng)殖動物的消化能力和對飼料的利用率，促進動物生長。
[0011] 所述枯草芽抱桿菌SY12可作為益生菌應用于草魚和南美白對郵的養(yǎng)殖生產中。 與對照組相比，飼喂本發(fā)明所述枯草芽抱桿菌SY12的實驗組草魚的增重率提高了 26. 8% ; 且實驗組草魚血清中溶菌酶、堿性憐酸酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶的酶活分別提高了 4. 1%、10. 5%、3. 9%、80. 4% ;實驗組草魚消化道中蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性分別提 高了 23. 2%、70. 1%、6. 2%。；飼喂包含枯草芽抱桿菌SY12的復合添加劑的實驗組中南美 白對郵的增重率和特定生長率分別提高了 17. 3%和9.4% ;且實驗組對郵血液中血細胞數 和呼吸爆發(fā)活力分別提高了 38. 4%和14. 7% ;實驗組對郵血清中酪氧化酶、超氧化物歧化 酶和一氧化氮合酶的酶活力分別提高了 42. 9%、3. 8%和21. 4%;實驗組對郵消化道中蛋白 酶和淀粉酶的酶活力分別提高了 62. 5%和71. 8%，均取得了顯著的技術效果。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1菌株的分離、篩選與鑒定 [001引1、樣品
[0014] 采集于青島市膠州南美白對郵養(yǎng)殖場養(yǎng)殖池水樣。 陽01引 2、培養(yǎng)基：
[0016] D2216E海水培養(yǎng)基：蛋白陳5g，酵母浸出物Ig，憐酸鐵O.Olg，海水1000ml， 抑7. 6-7. 8,配制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min。 陽017] 2)TSB培養(yǎng)基：膜蛋白腺大豆肉湯30g，氯化鋼15g，蒸饋水1000ml，pH7. 4-7. 6,配 制固體培養(yǎng)基加入15-20g的瓊脂，121°C滅菌20min。 陽0化]扣MRS培養(yǎng)基：蛋白腺lOg，牛肉膏l(xiāng)Og，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐溫-801ml，憐酸二氨鐘2g，巧樣酸二錠2g，乙酸鋼5g，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 15g，蒸饋水1000ml， P冊.2-6. 4,加入15-20g的瓊脂W配制固體培養(yǎng)基，115°C滅菌20min。
[0019] 4)淀粉水解培養(yǎng)基：蛋白腺lOg，牛肉膏5g，氯化鋼5g，可溶性淀粉2g，蒸饋水 1000ml，pH7. 4-7. 6,115Γ滅菌 20min。
[0020] 5)酪素水解培養(yǎng)基：溶液A:酵母膏3g、蛋白腺lOg、瓊脂lOg、海水1000ml;溶液 B:酪蛋白lOg、蒸饋水250ml;溶液C:瓊脂lOg、蒸饋水250ml;分別將立種溶液m°C滅菌 20min，冷卻后先將B液和C液混合，倒入平板形成一薄層，待薄層凝固后倒入A液，制成雙 層平板。
[0021] 3、篩選方法
[0022] 取1ml水樣，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，分別接種于2216E、TSB和MRS固體 培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2地-4她。選取均勻清晰的單菌落，劃線純化細菌。單菌落依此命名為SY1、SY2、SY3......、SY16。
[0023] W致病菌一一哈維弧菌和媛弧菌為指示菌，采用平板括抗法篩選益生菌。在涂有 指示菌的平板上點種待篩選的細菌菌液，28°C恒溫培養(yǎng)，4化內觀察點種區(qū)周圍是否出現抑 菌透明區(qū)或覆蓋區(qū)。對病原菌的抑制作用表示為抑菌圈直徑與菌落直徑的比值，1則沒有抑 制作用，1-2表示具有一定的抑制作用，〉2表示抑菌作用較強。具體結果見表1
[0024] 表1潛在益生菌株抑菌情況 陽0巧]
[00%] 從表1的數據可W看出，本發(fā)明篩選到的菌株中只有5株菌對哈維弧菌和媛弧菌 均具有一定的抑制作用，其中W菌株SY12的抑菌能力最強。
[0027] 將篩選出的SY1、SY2、SY5、SY8和SY12運5株病原菌括抗菌分別點種于淀粉水解 培養(yǎng)基和酵素水解培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)4化形成明顯菌落后觀察有無透明水解圈。產 酶能力表示為透明圈直徑與菌落直徑的比值，1表示不產生酶，1-2表示產酶能力一般，〉2 表示產酶能力較強。具體結果見表2 陽〇 2引表2潛在益生菌株產酶能力
[0029]
[0030] 從表2的數據可W看出，本發(fā)明篩選到的5株病原菌括抗菌中只有SY8和SY12產 蛋白酶和淀粉酶的能力均較強，而其中又WSY12菌株的綜合產酶能力最強。
[0031] 4、菌株鑒定
[0032] 1)菌落形態(tài)特征：將上述菌株SY12重新劃線培養(yǎng)，其菌落呈現為扁平狀，灰白色， 不透明，邊緣銀齒狀。 陽03引 2)提取上述菌株SY12的基因組