一種聯(lián)合新型tlr7激動(dòng)劑gd制備人cik細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)、腫瘤免疫治療領(lǐng)域，設(shè)及一種聯(lián)合新型化R7激動(dòng)劑GD制 備人CIK細(xì)胞的方法和抗腫瘤過繼免疫治療應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來隨著生活方式的改變W及自然環(huán)境的惡化，加上醫(yī)療技術(shù)的提高，腫瘤檢 出人數(shù)呈上升趨勢(shì)，腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要疾病之一。由于腫瘤具有較高的 損害性和較高的病死率，對(duì)抗腫瘤的治療手段的研究和應(yīng)用一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，腫瘤 免疫治療是臨床用于腫瘤治療的第四大療法，其中免疫細(xì)胞療法在中國(guó)得到廣泛的應(yīng)用， 目前國(guó)內(nèi)開展最多的就是免疫細(xì)胞過繼性回輸療法。
[0003] CIK細(xì)胞即細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞，是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外與多種細(xì)胞 因子共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的細(xì)胞毒性T淋己 細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高效的溶解毒性，DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)后，可W有效提高了CIK的增 殖能力和殺傷活性，更有利于提高CIK的抗腫瘤免疫療效，也是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的 免疫治療技術(shù)。
[0004] Toll樣受體（TLRs)是存在于不同類型細(xì)胞上的模式識(shí)別受體（pattern reco即itionrec巧tors，PRRs)，將運(yùn)些PRRs可W識(shí)別的特定分子模式歸為一類，稱作病原 體相關(guān)分子模式（pathogen-associatedmolecularpatte;rns，PAMPs)。PAMPs是病原體保 守結(jié)構(gòu)分子，和宿主的其他分子模式有很大區(qū)別，當(dāng)病原體侵襲宿主時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)針對(duì)病原 體相應(yīng)免疫程序，從而抵抗外來病原體侵襲而不影響宿主。運(yùn)種模式識(shí)別機(jī)制是機(jī)體抵抗 病原菌的第一道屏障，而Toll樣受體在運(yùn)個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。
[0005] 在化Rs家族中，TLR7是首先被發(fā)現(xiàn)可W由小分子化合物激活的Toll樣受體。TLR7 的配體有單鏈RNA(ssRNA)、非病毒來源物巧日多聚dT等)和化學(xué)合成的小分子化合物咪挫 哇嘟類W及鳥巧類似物等。化R7配體能特異激活化R7,有很強(qiáng)的佐劑作用，因此運(yùn)些化R7 配體中的大多數(shù)都可W作為免疫佐劑使用，如可W通過誘導(dǎo)前細(xì)胞因子產(chǎn)生抗病毒和抗腫 瘤作用?；疪7的天然配體是單鏈RNA(ssRNA)，雖然其也有很好的激動(dòng)作用，但是由于其容 易酶解，產(chǎn)生一系類生物毒性W及其制備成本高等特點(diǎn)，使其研究和應(yīng)用受到限制。雖然已 有研究對(duì)合成的ssRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，即提高RNA的穩(wěn)定性，也提高了免疫效應(yīng)。但是本發(fā) 明所用的合成小分子化R7配體具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、低毒性W及低成本等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明是將自主 研發(fā)的TLR7 激動(dòng)劑GD[Gaoetal.ChemMedChem, 2015，10 化）：977-980]作為免疫刺激 因子在腫瘤免疫治療中使用，從而制備出更有效的CIK細(xì)胞，稱之為GD-CIK。經(jīng)過化R7激 動(dòng)劑GD刺激CIK細(xì)胞活化，刺激更多的細(xì)胞刺激因子分泌，產(chǎn)生共協(xié)同刺激作用，具有更好 的殺瘤活性。
[0006] 治療腫瘤中，聯(lián)合療法逐漸得到重視，TLR7激動(dòng)劑聯(lián)合化療、其他免疫療法的報(bào)道 也日漸增多，但都屬于簡(jiǎn)單的疊加范疇，基于共刺激，聯(lián)合治療理念的CIK細(xì)胞未見報(bào)道。 本發(fā)明通過化R7激動(dòng)劑，小分子化合物GD聯(lián)合常規(guī)細(xì)胞因子，共刺激，誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，旨在 聯(lián)合天然免疫，增強(qiáng)腫瘤殺傷作用。在體外實(shí)現(xiàn)聯(lián)合療法理念，降低體內(nèi)聯(lián)合療法風(fēng)險(xiǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過化R7小分子激動(dòng)劑GD優(yōu)化的CIK 細(xì)胞的基礎(chǔ)上，提供了一種聯(lián)合治療理念的人CIK細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用，即GD-CIK，解 決了現(xiàn)有技術(shù)CIK細(xì)胞培養(yǎng)后，異質(zhì)性細(xì)胞群體細(xì)胞毒活性提高不顯著等問題；得到可W 用于臨床的殺傷效率更高的抗腫瘤過繼免疫活性細(xì)胞。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種聯(lián)合新型化R7激動(dòng)劑GD制備人CIK細(xì)胞的方法，其特征集中于所述包括步驟： 1) 外周靜脈血采集，分離，獲得單個(gè)核細(xì)胞； 2)DayO,在常規(guī)CIK細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入新型化R7激動(dòng)劑GD，后續(xù)仿照常規(guī)，進(jìn)行CIK 細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)； 3)GD-CIK細(xì)胞增殖培養(yǎng)。
[0009] 作為優(yōu)選，所述步驟1):抽取人的靜脈外周血于含有肝素鋼的離屯、管中，離屯、獲得 血清和全血細(xì)胞，將全血細(xì)胞經(jīng)密度梯度離屯、獲得單個(gè)核細(xì)胞。
[0010] 進(jìn)一步地，所述步驟1):具體為采用聚薦糖-泛影葡糖胺密度梯度離屯、法分離收 集，并用生理鹽水洗涂2次，低速離屯、后獲得PBMCs。
[0011] 所述步驟2):具體為將獲取的PBMCs重懸于GT-T551?培養(yǎng)基中，加入各種細(xì)胞因 子，然后于37°C，5%C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)按照CIK細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)方案進(jìn)行。DayO， 將GD加入至前述CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)13-15天，收獲GD-CIK細(xì)胞。
[0012] 細(xì)胞組成：CD3陽性表達(dá)率在90%W上，CD3+CD4+細(xì)胞約在10-30%，CD3+CD8+細(xì)胞 在 50-70%，CD3+CD56+ 細(xì)胞約在 5-10%，CD3CD56+ 細(xì)胞約在 5-15〇/〇。
[0013] 本發(fā)明所提供的人GD-CIK細(xì)胞，是指WCD3+CD8+和CD3 +CD56+T淋己細(xì)胞為主效 應(yīng)細(xì)胞，與K562細(xì)胞共培養(yǎng)18小時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性可達(dá)98 %左右(效祀比，20:1)。
[0014] 本文中的"CD3+CD4乂IK細(xì)胞"表示CD3和CD4均為陽性的CIK細(xì)胞。"CD3+CD8乂IK 細(xì)胞"表示CD3和CD8均為陽性的CIK細(xì)胞。"CD3+CD56乂IK細(xì)胞"表示CD3和CD56均為陽 性的CIK細(xì)胞。"CD3CD56+細(xì)胞"表示CD3陰性和CD8陽性的細(xì)胞。
[0015] 上述方法培養(yǎng)的GD-CIK與常規(guī)培養(yǎng)制備的CIK相比，殺瘤活性明顯增加，體外 實(shí)驗(yàn)時(shí)殺瘤活性達(dá)到98%W上，明顯高于常規(guī)方法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞。同時(shí)也具有制備成本 低廉、工序簡(jiǎn)單、條件易控、對(duì)設(shè)備的要求較低、易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。通過本發(fā)明所制備 的GD-CIK細(xì)胞應(yīng)用主要是癌癥病人的治療或者癌癥高危人群的預(yù)防。
【附圖說明】
[0016] 圖1:成熟CIK細(xì)胞團(tuán)形態(tài)。培養(yǎng)第15天，成熟CIK在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大 倍率為40X; 圖2 :培養(yǎng)第15天流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行GD-CIK成熟度檢測(cè)。
[0017] 圖3:不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs生長(zhǎng)曲線（n=3);外周血來源的 PBMCs通過不同方式培養(yǎng)，在第0、3、5、7、9、11、13、15天分別用細(xì)胞計(jì)數(shù)板和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn) 行計(jì)數(shù)，將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除W開始培養(yǎng)時(shí)(第0天）的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值即為細(xì)胞增殖倍 數(shù)。CIK組：指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；GD-CIK組：指本發(fā)明所采 用的培養(yǎng)方式； 圖4 :采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型檢測(cè)（n=3)。外周血來源的PBMCs，通過不同方式培 養(yǎng)，在第14天取細(xì)胞進(jìn)行流式巧光抗體：抗CD3-門TC、CD4-PE、CD8-陽CY5、CD56-APC進(jìn)行 表面染色并檢測(cè)。CIK組：指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；GD-CIK組：指 本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。
[0018] 圖5 :采用CCK-8細(xì)胞毒活性檢測(cè)試劑盒，對(duì)不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源 PBMCs進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)（n=3)。通過不同方式培養(yǎng)，在第14天取細(xì)胞通過CCK-8試劑盒進(jìn) 行細(xì)胞毒活性檢測(cè)。CIK組：指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；GD-CIK組： 指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。橫坐標(biāo)：表示效祀細(xì)胞比值，E:Τ=20 : 1表示效應(yīng)細(xì)胞與祀 細(xì)胞的比值為20 : 1，Ε:Τ=10 : 1表示效應(yīng)細(xì)胞與祀細(xì)胞的比值為10 : 1，Ε