基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌（tb）耐藥性基因的檢測(cè)技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000。 本發(fā)明設(shè)及基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)的結(jié)核分枝桿菌（i知oAac妃riu曲 耐藥性基因的檢測(cè)技術(shù)。具體而言，本發(fā)明設(shè)及用于基于焦憐酸測(cè)序技 術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因的測(cè)序引物。本發(fā)明還設(shè)及包含測(cè)序引物的用于基 于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因的試劑盒和微陣列。本發(fā)明還設(shè)及 測(cè)序引物在制備用于基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因的試劑盒和 微陣列中的用途。本發(fā)明還設(shè)及使用測(cè)序引物檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基 因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 焦憐酸測(cè)序技術(shù)是一種基于酶與底物的級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)并定量的序列分析技 術(shù)。在整個(gè)反應(yīng)體系中，W單鏈的PCR產(chǎn)物作為模板，測(cè)序引物與其退火結(jié)合，四種dNTP按 照既定的順序加到反應(yīng)體系中。如果加入的dNTP與模板鏈上的堿基互補(bǔ)結(jié)合，在DNA聚 合酶的作用下釋放與滲入量等摩爾數(shù)的焦憐酸基團(tuán)PPi。硫酸化酶催化釋放的PPi與腺 巧-5' -憐酸硫酸酢形成等量的腺嚷嶺核巧Ξ憐酸（AdenosineTriphosphate,ATP)，ATP 驅(qū)動(dòng)巧光素酶介導(dǎo)的巧光素向氧化態(tài)轉(zhuǎn)化，并發(fā)生光信號(hào)。儀器檢測(cè)到的光信號(hào)則W巧光 信號(hào)峰的方式反映在實(shí)時(shí)出現(xiàn)的測(cè)序圖譜中。如加入的dNTP不能與模板互補(bǔ)結(jié)合，則直接 被雙憐酸酶降解，反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)入下一輪。通過(guò)上述過(guò)程的循環(huán)，單鏈的PCR產(chǎn)物得到互補(bǔ) 并延伸，通過(guò)各堿基位置信號(hào)峰的有無(wú)判斷堿基類型，通過(guò)信號(hào)峰的高度和面積判斷堿基 的數(shù)目。焦憐酸測(cè)序法適于對(duì)lO-lOObp長(zhǎng)度序列進(jìn)行定量分析，其重復(fù)性和精確性能與 Sanger測(cè)序媳美，而檢測(cè)速度則大大提高。多重焦憐酸測(cè)序技術(shù)在保持焦憐酸測(cè)序技術(shù)優(yōu) 勢(shì)的同時(shí)，增強(qiáng)其對(duì)于相距l(xiāng)(K)bpW上位點(diǎn)的檢測(cè)能力。兩個(gè)甚至多個(gè)測(cè)序反應(yīng)在同一孔 位中同時(shí)進(jìn)行，通過(guò)科學(xué)的編排四種dNTP加入的順序獲得特異的檢測(cè)序列，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè) 相距較遠(yuǎn)的位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)。
[0003] 臨床上對(duì)結(jié)核分枝桿菌引起的肺結(jié)核常用的一線藥物包括異煙阱（INH)、利福平 (RFP)、鏈霉素（SM)等。異煙阱其作用機(jī)制是被結(jié)核分枝桿菌內(nèi)過(guò)氧化氨酶-過(guò)氧化物酶 激活，作用于締酷基載體蛋白還原酶，抑制分枝桿菌細(xì)胞壁生物合成而殺菌。katG基因是編 碼觸酶-過(guò)氧化物酶的編碼基因，其基因突變可導(dǎo)致過(guò)氧化氨酶-過(guò)氧化物酶活性下降甚 至喪失。katG基因突變約占異煙阱耐藥的50~70%。InM基因編碼還原型煙酷胺二核巧酸 (NADH)依賴的締酷基還原酶，其基因突變約占異煙阱耐藥10~35%。
[0004] 利福平是一種廣譜抗菌藥，可與DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合，抑制RNA 聚合酶活性，進(jìn)而抑制mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成起到抗菌作用。約95%的利福平耐藥菌都是 由于編碼RNA聚合酶β亞基（rpoB)基因發(fā)生突變，從而不再與利福平結(jié)合而產(chǎn)生耐藥性。 巧oB基因突變主要發(fā)生在507-533位編碼27個(gè)氨基酸密碼子的8化P的區(qū)域內(nèi)。
[0005] 現(xiàn)已有多種生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)，如隧菌體生物擴(kuò)增 法、常規(guī)藥敏試驗(yàn)、DM測(cè)序、基因忍片、PCR-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析、快速培養(yǎng)儀檢測(cè) 系統(tǒng)等。
[0006] 隧菌體生物擴(kuò)增法和常規(guī)藥敏試驗(yàn)操作繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)不易標(biāo)準(zhǔn)化?；蛉唐瑯颖镜?審恪和標(biāo)記較繁瑣，儀器昂貴，檢測(cè)成本高。PCR-限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析只能分析已知 序列特異位點(diǎn)的基因突變。快速培養(yǎng)儀檢測(cè)系統(tǒng)儀器和試劑依賴進(jìn)口，費(fèi)用高昂。同時(shí)一 些非測(cè)序方式需要依賴酶切或聚類的方式判讀患者的基因突變情況，存在較大的分型錯(cuò)誤 的幾率。直接測(cè)序雖然準(zhǔn)確度高，但測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的DNA片段需要經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳分離，其 后由檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)巧光信號(hào)，耗時(shí)較長(zhǎng)且檢測(cè)成本較高。
[0007]焦憐酸測(cè)序法可對(duì)一定長(zhǎng)度內(nèi)序列進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，其重復(fù)性和精確性能與 Sanger測(cè)序媳美，而檢測(cè)速度大大提高，檢測(cè)成本明顯降低。此外，焦憐酸測(cè)序技術(shù)的檢測(cè) 靈敏度也遠(yuǎn)高于Sanger測(cè)序。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定及分法醫(yī)學(xué)鑒、遺傳學(xué) 分析、SNP檢測(cè)等方面。因此，焦憐酸測(cè)序技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因（inM、katG、rpoB) 檢測(cè)的應(yīng)用與推廣將具有極大價(jià)值與潛力。
[0008] 然而，目前尚沒(méi)有商業(yè)化實(shí)現(xiàn)焦憐酸測(cè)序技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因檢 測(cè)的方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明一方面設(shè)及用于基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因 的測(cè)序引物，所述測(cè)序引物包含至少一個(gè)選自W下的核巧酸序列：SEQIDNO: 3、9、15、19 和23W及它們的任意組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)序引物具有至少一個(gè)選自W下的核 巧酸序列，或者由或基本由至少一個(gè)選自W下的核巧酸序列組成：SEQIDNO: 3、9、15、19 和23化及它們的任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述測(cè)序引物針對(duì)的祀標(biāo)序列為選自W 下的序列：SEQIDNO: 6、12、18、22和26W及它們的任意組合。
[0010] 本發(fā)明一方面設(shè)及用于基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因 的測(cè)序引物組，所述測(cè)序引物組包括： 包含或具有選自SEQIDNO: 3、9、15、19和23之一的核巧酸序列的測(cè)序引物，和 包含或具有選自SEQIDNO: 3、9、15、19和23的另外一個(gè)、另外兩個(gè)、另Ξ個(gè)或全部另 外四個(gè)的核巧酸序列的測(cè)序引物。
[0011] 本發(fā)明另一方面設(shè)及一種用于基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥 性基因的試劑盒或微陣列，其包含本發(fā)明的測(cè)序引物或測(cè)序引物組。本發(fā)明另一方面設(shè)及 本發(fā)明的測(cè)序引物或測(cè)序引物組在制備用于基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝 桿菌（TB)耐藥性基因的試劑盒或微陣列中的用途。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒或微陣列還包含至少一種選自W下的引物組： 1) 引物組1，其包含具有由SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列的引物和具有由SEQID NO: 2所示的核巧酸序列的引物； 2) 引物組2,其包含具有由SEQIDNO: 7所示的核巧酸序列的引物和具有由SEQID NO: 8所示的核巧酸序列的引物； 3) 引物組3,其包含具有由SEQIDNO: 13所示的核巧酸序列的引物和具有由SEQID NO: 14所示的核巧酸序列的引物；和 4)它們的任意組合。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒或微陣列還包含表明至少一種選自W下的待分析 序列和分配順序的說(shuō)明書(shū)： 1) 由SEQIDNO: 4所示的待分析序列和由SEQIDNO: 5所示的分配順序； 2) 由SEQIDNO: 10所示的待分析序列和由SEQIDNO: 11所示的分配順序； 3) 由SEQIDNO: 16所示的待分析序列和由SEQIDNO: 17所示的分配順序； 4) 由SEQIDNO: 20所示的待分析序列和由SEQIDNO: 21所示的分配順序訊 5) 由SEQIDNO: 24所示的待分析序列和由SEQIDNO: 25所示的分配順序。
[0014] 本發(fā)明還設(shè)及一種基于焦憐酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性 基因的方法，所述方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的DNA， (2) 將提取和任選純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，從而獲得擴(kuò)增產(chǎn)物， (3) 對(duì)步驟（2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦憐酸測(cè)序。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述焦憐酸測(cè)序使用本發(fā)明的測(cè)序引物或測(cè)序引物組進(jìn)行。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增為PCR擴(kuò)增，優(yōu)選所述PCR擴(kuò)增使用本發(fā)明的引物組。在又 一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)樣品中的結(jié)核分枝桿菌（TB)耐藥性基因的方法可不用于診斷受試者 的耐藥性，例如可用于檢測(cè)體外培養(yǎng)中的結(jié)核分枝桿菌是否變異，可用于檢測(cè)環(huán)境來(lái)源的 結(jié)核分枝桿菌樣品是否具有耐藥性。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述焦憐酸測(cè)序還使用至少一種選自W下的待分析序列和分 配順序： 1) 由SEQIDNO: 4所示的待分析序列和由SEQIDNO: 5所示的分配順序； 2) 由SEQIDNO: 10所示的待分析序列和由SEQIDNO: 11所示的分配順序； 3) 由SEQIDNO: 16所示的待分析序列和由SEQIDNO: 17所示的分配順序； 4) 由SEQIDNO: 20所示的待分析序列和由SEQIDNO: 21所示的分配順序訊 5) 由SEQIDNO: 24所示的待分析序列和由SEQIDNO: 25所示的分配順序。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品為生物樣品，優(yōu)選所述樣品為體液樣品或組織樣品， 和更優(yōu)選所述樣品選自活組織檢查樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物、經(jīng)固化處理的樣品巧日石蠟包埋樣 品)、全血、血漿、血清、唾液、腦髓液、汗液、疲、肺泡灌洗液、尿液、糞便、分泌液、乳汁、腹膜 液。