與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標記genSSR3000及獲取、應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體設及與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標記 genSSR3000及獲取方法和應用。
【背景技術】
[0002] 辣椒（CapicumannuumL.)是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物。黃瓜花葉 病毒（化州mbermosaicvirus,CMV)是一種毀滅性病害，是危害辣椒的主要病毒之一。 CMV常引起辣椒葉型崎形皺縮，嚴重時植株萎縮，果實小而發(fā)硬，導致產(chǎn)量下降，品質(zhì)降 低。CMV可嚴重影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)，一般年份可造成辣椒減產(chǎn)20% -30%，嚴重時可達 50% -60%。在栽培生產(chǎn)過程中為防治辣椒CMV病害而頻繁施用的化學農(nóng)藥，已經(jīng)影響到 辣椒產(chǎn)品的食用安全，對人體健康構成了嚴重威脅，也對生態(tài)環(huán)境造成了污染。實踐表明， 培育抗病品種是防治病害最經(jīng)濟有效的方法。同時發(fā)掘辣椒種質(zhì)資源的優(yōu)異抗CMV基因， 對其進行分子水平的遺傳解析，對于明確抗病基因作用的分子機理和抗病育種具有重要意 義。
[0003] 辣椒CMV抗性遺傳規(guī)律復雜，不同的抗原材料抗病遺傳模式不同。根據(jù)系列研究 報道和發(fā)明人課題組做過的遺傳規(guī)律研究，絕大多數(shù)CMV抗性材料抗性表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺 傳模式，大家紛紛針對手中的CMV抗性材料進行了giL定位，但由于抗性材料不同或CMV毒 源不同，Q化定位結(jié)果相互間差異很大，難W比較。根據(jù)W往研究報道，僅有極少數(shù)材料CMV 抗性由單基因控制，如韓國報道B址ang的CMV抗性由單顯性基因控制，并針對此單顯性基 因開發(fā)出了緊密連鎖的分子標記。然而至今，尚未有與辣椒CMV抗性單隱性基因緊密連鎖 的分子標記的相關研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標記genSSR3000。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案實現(xiàn)的：
[0006] 與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標記genSSR3000,所述分子標記具有序列表 中的SEQIDNO: 1~2的至少一個的核巧酸堿基序列。
[0007] 所述分子標記應用辣椒材料中cr基因的檢測。
[0008] 與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標記genSSR3000的應用，其特征在于：
[0009] 所述檢測包括W下步驟：
[0010] 辣椒材料基因組DNA提取步驟：對辣椒材料進行提取處理，得到辣椒材料基因組 DNA；
[0011] PCR擴增反應步驟：W所述分子標記作為PCR引物，W該辣椒材料基因組DNA作為 模板，進行PCR擴增反應，得到擴增產(chǎn)物；
[0012] 分析步驟：將所述擴增產(chǎn)物進行電泳分離處理，顯色處理，再統(tǒng)計分析所述辣椒材 料是否含有cr基因。
[0013] 在上述檢測優(yōu)選的實施方式中，所述PCR擴增反應步驟中，PCR標記反應體系中含 有：
[0014] 模板DNA0.5-2.0ng/yL正向、反向引物各l-lOng/yLdNTP各 100-500μπιο1/ レMgCl2l-5mmol/^，TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/μレ體積百分比為10-20%的10XTaq Buffer;
[001引示例性地，所述PCR標記反應體系中各個成分的含量可W為W下任意值或任意值 之間的范圍：
[001 引模板DNA0. 5ng/μL、Ing/μL、1. 5ng/μL、化g/μL，正向、反向引物各Ing/μL、 2ng/yL、6ng/yL、8ng/yL、10ng/yL，dNTP各 100ymol/L、200ymol/L、300ymol/L、 400μmol/L、500μmol/L，MgClz1mmol/1,. 2mmo1 /T,.3mnio1 /1,.4mmo1 /1,.5mnio1 /1,.TaqDNA 聚合酶 0.lU/yL、0. 2U/yL、0. 3U/yL、0. 4U/yL、0. 5U/yL，10XTaqBuffer:10%、12%、 15%、18%、20% ;
[0017] 優(yōu)選地，所述PCR標記反應體系中含有：
[001引 模板DNA1.6叫/化，正向、反向引物各5叫/化，dNTP各100μL?οΙ/Ι，MgClz Immol/l，TaqDNA聚合酶 0.?υ/μL^，體積百分比為 10%的lOXTaqBuffer。
[0019] 在上述檢測優(yōu)選的實施方式中，所述PCR擴增反應步驟中，PCR標記反應體系中含 有：
[0020] 體積百分含量為10-50%的模板0臟化5叫/化)，正向、反向引物巧化邑/化）的 體積百分含量各5-15 %，體積百分含量為40-60 %的GoTaq形GreenMastermix;
[0021] 示例性地，所述PCR標記反應體系中各個成分的含量可W為W下任意值或任意值 之間的范圍：
[0022] 模板DNA化 5ng/yL) :10%、20%、30%、40%、50%，正向、反向引物巧0ng/μL) 各：5%、10%、12%、15%，G〇T叫飯GreenMastermix:40%、45%、50%、55%、60% ;
[0023] 優(yōu)選地，PCR標記反應體系中含有：
[0024] 體積百分含量為30%的模板DNA化5ng/μL)，正向、反向引物巧化g/μL)的體積 百分含量各10%，體積百分含量為50%的GoTaq翁'GreenMastermix;
[00巧]更優(yōu)選地，10μL的PCR標記反應體系中含有：
[002引 3μL的模板DNA化5ng/μL)，正向、反向引物巧Ong/μL)各1μL，5μL的 GoTaq巧GreenMastermix。
[0027] 在上述檢測優(yōu)選的實施方式中，所述PCR擴增反應步驟中，PCR反應程序為：94°C 預變性4min;94°C變性15s，55°C退火15s，72°C延伸30s，34個循環(huán)；72°C保溫5min。
[0028] 與辣椒CMV抗性基因緊密連鎖的分子標記genSSR3000的獲取方法，包括W下步 驟：
[0029] 將辣椒供試材料進行苗期抗病接種鑒定，W明確CMV抗性由單隱性基因cr控制； 再利用SSR引物和InDel引物進行篩選和分離，得到所述與辣椒CMV抗性基因cr緊密連鎖 的分子標記genSSR3000。
[0030] 本發(fā)明的有益效果為：
[0031] 本發(fā)明直接將篩選獲得的PCR引物作為分子標記使用，可W準確地檢測到辣椒材 料是否含有cr基因，本發(fā)明方法方便、快捷、節(jié)約成本。
【附圖說明】
[0032] 圖1為實施例1中CMV抗性由單隱性基因控制的辣椒材料Q132的選育方法的流 程示意圖。
[0033] 圖2為實施例1中花藥培養(yǎng)步驟中得到的胚狀體的照片。
[0034] 圖3為實施例1中再生植株培養(yǎng)步驟中得到的再生株的照片。
[003引圖4為實施例1中馴化移栽步驟中得到的植株的照片。
[0036] 圖5為實施例2中辣椒幼苗單株CMV病情7級的植株的照片。
[0037] 圖6為實施例2中辣椒幼苗單株CMV病情5級的植株的照片。
[003引圖7為實施例2中辣椒材料Q132CMV抗性連鎖分析示意圖。
[0039] 圖8為實施例2中與辣椒cr基因連鎖的genSSR分子標記的驗證結(jié)果電泳圖。
【具體實施方式】
[0040] W下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。
[00川實施例1 :
[0042] 本實施例為CMV抗性由單隱性基因控制的辣椒材料Q132的選育方法和鑒定方法。 在獲得CMV抗性由單隱性基因控制的辣椒材料Q132的基礎上，才有可能進行與辣椒CMV抗 性基因緊密連鎖的分子標記的獲取開發(fā)。
[0043] 其中，上述選育方法包括W下步驟，如圖1所示。
[0044] (1)選取雜交材料：選取從國內(nèi)外引進的四份優(yōu)良辣椒雜交種："37-74"、"喜洋 洋"、"帕沃爾"、"圣保羅"。
[0045] 其中/'37-74"購自瑞克斯旺（中國）種子有限公司，"喜洋洋"購自昌樂新盛種業(yè) 有限公司，"帕沃爾"購自日本坂田種苗（蘇州）有限公司圣保羅"購自紐內(nèi)姆（北京） 種子有限公司。
[004引似雜交對上述四份雜交材料進行兩兩雜交："37-74"與"喜洋洋"雜交得到單交 雜種1，"帕沃爾"與"圣保羅"雜交得到單交雜種2 ;再將單交雜種1和單交雜種2雜交，得 到雙交雜種。
[0047] (3)單倍體培育：將該雙交雜種進行花藥培養(yǎng)，再經(jīng)過CMV人工接種抗性鑒定，得 到高抗CMV的DH株系Q132 (即為高抗CMV的辣椒材料Q132)。
[0048] ①選取花蕾：在上述雙交雜種中，選擇長勢良好、無病蟲害的植株作為供體植株，