糞菌保存液及其保存糞菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測領(lǐng)域，特別涉及一種糞菌保存液以及采用此保存液保存糞菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道菌群的結(jié)構(gòu)失調(diào)是誘發(fā)各種慢性病的重要因素，近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)通過“奠菌移植”(fecal microb1ta transplantat1n，F(xiàn)MT)，即用來自健康人的腸道菌群，恢復(fù)慢性病人體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的平衡，重建具有正常結(jié)構(gòu)的腸道微生態(tài)，可以促進菌群功能的康復(fù)，從而達到腸道及腸道外疾病的治療效果。迄今，國內(nèi)外均有采用糞菌移植方法成功治愈或緩解難辨梭狀芽孢桿菌感染(CDI)、炎癥性腸病等胃腸道相關(guān)性疾病的臨床報道。2013年，美國FDA將FMT收錄到復(fù)發(fā)性CDI的標準治療指南中。雖然“糞菌移植”的治療臨床效果顯著，但是其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的推廣和應(yīng)用仍有諸多問題有待解決，比如FMT的標準化建立。其中，糞菌液的保存是FMT中的必要步驟。當(dāng)菌群離開腸道后，其所處環(huán)境即發(fā)生變化，其活性和構(gòu)成比例可能會受到影響。為了保證臨床移植的治療效果，需采用一種有效的保存方法和手段來維持腸道菌群的活性和構(gòu)成比例。
[0003]目前臨床上一般采用冷藏法用于直接保存人體糞便，即當(dāng)糞便采集后立即凍存在-20°C或者更低的溫度中，由于細菌在低溫狀態(tài)下代謝速率降低，因此可以在一段時間內(nèi)維持糞便中細菌的構(gòu)成，從而達到穩(wěn)定其微生物構(gòu)成的目的。當(dāng)需要進行FMT操作時，將凍存品再通過分離方法得到糞菌，這不僅增加了糞菌分離的難度和工作量，也需要更大的存儲空間。此外，糞菌如作為一種治療方法中的“藥品”，不能夠直接在臨床中應(yīng)用，反而需要先凍存糞便再提取后使用，這樣的治療過程無疑會增加操作和設(shè)備的依賴性，會阻礙糞菌移植治療方法的發(fā)展。同時，我國很多醫(yī)療機構(gòu)并不具備對糞菌進行分離的能力。因此，盡管專利文獻一種糞便保存液(CN104480012A)報道了利用Η)ΤΑ鹽及檸檬酸鈉等物質(zhì)，以水和乙醇作為溶劑配制的保存液能夠?qū)⒓S便樣本在密封常溫下保存一周，但這種方法不適于對糞菌移植中的糞菌進行保存。
[0004]目前臨床在糞菌移植過程中常采用磷酸鹽緩沖液(PBS)與供體糞菌混合，由于混合液的流體特征，臨床上采用內(nèi)鏡下噴射或者灌腸過程中，與腸道壁接觸時間短，影響糞菌定植效果。糞菌液如需保存，則需要額外加入甘油，過多的步驟容易增加外源性感染的機會。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供能夠有效保護腸道菌群活性和豐度。從而保證糞菌移植效果的保存液，以及采用上述保存液保存糞菌的方法。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種糞菌保存液，按重量百分比包括以下組分:0.9 %的氯化鈉，0.5 %?2.0 %的維生素C，20 %?50 %的甘油，其余為無菌純化水，所述保存液的pH值為7.0?7.4。
[0007]—種保存液保存糞菌的方法，包括以下步驟:
(1)將收集糞便分離后得到的糞菌，每50g糞便得到的糞菌用100mL保存液重懸，然后在_80°C凍存保存；
(2)使用時，先將糞菌凍存物在冰浴中解凍，然后稀釋到250mL的無菌生理鹽水中，供糞菌移植使用。
[0008]本發(fā)明涉及一種糞菌保存液的配方，按照配方所述配制糞菌保存液。將采集的新鮮糞便，經(jīng)攪拌、離心、重懸、過濾等步驟直接采用糞菌保存液保存，或者直接采用糞菌分離系統(tǒng)分離得到糞菌，然后直接將糞菌置于保存液中，-80°C以下凍存，即可達到穩(wěn)定其中微生物構(gòu)成的作用，保存時間長達3個月。使用該配方保存液，在相應(yīng)的保存條件下，能夠保證糞菌中微生物的數(shù)量和豐度不影響后續(xù)糞菌移植的治療效果，為糞菌移植標準化提供了可能。
[0009]本發(fā)明中的糞菌保存液很好地保護了腸道菌群的活性和豐度，從而保證了糞菌移植效果，同時也簡化了糞菌移植操作，目前臨床上無本發(fā)明所描述的類似產(chǎn)品或方法面市。
[0010]本發(fā)明配方能夠在簡單的保存條件下，對糞菌進行長達3個月的保存，保證其微生物構(gòu)成仍與最初分離提取時的微生物構(gòu)成相似。從配方構(gòu)成角度來看，本發(fā)明具有成本低，配制簡單等特點，這將有助于糞菌治療的發(fā)展；從具體實施案例的結(jié)果來看，本發(fā)明的配方，能夠?qū)崿F(xiàn)在常規(guī)保存條件下，維持糞菌長達3個月基本不變，這為糞菌移植標準化提供了主要保障。
【附圖說明】
[0011]圖1是實施例中4位志愿者的糞便樣本做3種不同處理后的DNA擴增結(jié)果比較。
[0012]圖2是實施例中3位志愿者的糞便樣品用糞菌液保存前后的細菌豐富度圖變化。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0014]—種糞菌保存液，按重量百分比包括以下組分:0.9%的氯化鈉，0.5%的維生素C，50%的甘油，其余為無菌純化水，保存液的pH值為7.4。
[0015]將收集糞便分離后得到的糞菌，每50g糞便得到的糞菌用100mL保存液重懸，然后在-80°C凍存保存。
[0016]使用時，先將糞菌凍存物在冰浴中解凍，然后稀釋到250mL的無菌生理鹽水中，供糞菌移植使用。
[0017]采集了 4位志愿者的糞便樣本，并利用糞菌分離系統(tǒng)分離得到對應(yīng)的糞菌。每個志愿者的糞菌分為3份，分別做3種不同處理:
(1)立即處理:將一份分離得到的糞菌分散在無菌生理鹽水中，每50g糞便分離得到的糞菌分散于100mL生理鹽水。取300 yL，立即進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區(qū)擴增等處理。
[0018](2)糞菌保存液_80°C保存3個月:將一份分離得到的糞菌分散在糞菌保存液中，每50g糞便分離得到的糞菌分散于100mL保存液，-80°C凍存3個月。然后冰浴解凍后取300 μ L，進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區(qū)擴增等處理。
[0019](3)不加保存液-80°C保存3個月:將一份分離得到的糞菌分散在無菌生理鹽水中，每50g糞便分離得到的糞菌分散于100mL生理鹽水，-80°C凍存3個月。然后冰浴解凍后取300 μ L，進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區(qū)擴增等處理。
[0020]4位志愿者的糞便樣本進行DNA提取，核糖體16S RNA基因第四可變區(qū)擴增處理的步驟如下:
(l)DNA 提取:
將300 μ L糞菌溶液置于含0.1mm硅球的1.5mL離心管中；然后，加入含50 μ L溶菌酶(10mg/ml)、6 μ L變?nèi)芫?25000U/mL)和3 μ L溶葡球菌酶的PBS，充分混勻后37°C溫育30分鐘；接著，加入10 μ L蛋白酶K(20mg/ml)、100 μ L濃度為10%的SDS (十二烷基苯磺酸鈉)和20 yL核糖核酸酶A(20mg/ml)，渦旋震蕩充分混勻后55°C溫育45分鐘；隨后，采用磨珠均質(zhì)器裂解細胞；最后按說明書使用ZYMO Research公司的糞便DNA提取試劑盒提取純化DNA。
[0021](2)核糖體16S RNA基因第四可變區(qū)擴增:
試劑(Takara公司):
引物:上游:27F-59-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-39 和下游 338R-59-GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAG-T-39 ；.Taq DNA 聚合酶；.MgC12 ；2.5mmol/L dNTP Mixture ；ddH20 ；lOx Ex Taq Buffer (不含鎂離子)；DNA模板。
[0022]操作步驟:
每個 PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L，包括:15.75 μ L ddH20, 2.5 μ L 10x Ex Taq Buffer，2yLdNTP Mixture, 1.5 yL MgCl2,0.25 μ L Taq DNA 聚合酶，上游引物和下游引物各 0.5 μ L，2 μ L 模板 DNA。
[0023]在每個EP管中分裝好每個25 μ L的PCR反應(yīng)體系后，按照以下PCR程序擴增反應(yīng):
(step 1):94 °C, 2min ； (step 2):92 °C, 30s ； (step 3):52 °C, 30s ； (step 4):72 °C,45s ； (step 5):go to step 2，29cycles ; (step 6):72°C, 5min ； (step 7):4°C, forever ；(step 8):end
擴增得到的片段，送往測序公司進行高通量測序，獲得序列后進行后續(xù)生物信息分析，得到菌群結(jié)果。
[0024]4位志愿者的糞便樣本做3種不同處理后的DNA擴增結(jié)果比較見圖1。圖中:
1.志愿者1樣品立即處理；2.志愿者1樣品保存液-80°c保存3個月；3.志愿者1樣品直接-80°C保存3個月；4.志愿者2樣品立即處理；5.志愿者2樣品保存液-80°C保存3個月；6.志愿者2樣品直接-80°C保存3個月；7.志愿者3樣品立即處理；8.志愿者3樣品保存液-80°C保存3個月；9.志愿者3樣品直接-80°C保存3個月；10.志愿者4樣品立即處理；11.志愿者4樣品保存液_80°C保存3個月；12.志愿者4樣品直接_80°C保存3個月；M:Marker。
[0025]3位志愿者糞便樣品用糞菌液保存的樣品進行處理，并送測序公司進行高通量測序，通過生物信息學(xué)方法分析，細菌豐富度對比比較見圖2。圖中可以看出:糞便細菌組成相似，每種菌群豐度變化不明顯，說明糞菌保存液可以保證糞菌在_80°C條件下保持良好的活性及菌群組成，為今后的糞菌移植工作提供保障。
[0026]如上所述，盡管參照特定的優(yōu)選實施例已經(jīng)表示和表述了本發(fā)明，但其不得解釋為對本發(fā)明自身的限制。在不脫離所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明的精神和范圍前提下，可對其在形式上和細節(jié)上作出各種變化。
【主權(quán)項】
1.一種糞菌保存液，其特征在于按重量百分比包括以下組分:0.9%的氯化鈉，0.5%?2.0%的維生素C，20%?50%的甘油，其余為無菌純化水，所述保存液的pH值為7.0 ?7.4o2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的糞菌保存液保存糞菌的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將收集糞便分離后得到的糞菌，每50g糞便得到的糞菌用100mL保存液重懸，然后在_80°C凍存保存； (2)使用時，先將糞菌凍存物在冰浴中解凍，然后稀釋到250mL的無菌生理鹽水中，供糞菌移植使用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種糞菌保存液以及采用上述保存液保存糞菌的方法，糞菌保存液，按重量百分比包括以下組分：0.9％的氯化鈉，0.5％～2.0％的維生素C，20％～50％的甘油，其余為無菌純化水，所述保存液的pH值為7.0～7.4。本發(fā)明配方能夠在簡單的保存條件下，對糞菌進行長達3個月的保存，保證其微生物構(gòu)成仍與最初分離提取時的微生物構(gòu)成相似。從配方構(gòu)成角度來看，本發(fā)明具有成本低，配制簡單等特點，這將有助于糞菌治療的發(fā)展；從具體實施案例的結(jié)果來看，本發(fā)明的配方，能夠?qū)崿F(xiàn)在常規(guī)保存條件下，維持糞菌長達3個月基本不變，這為糞菌移植標準化提供了主要保障。
【IPC分類】C12N1/04
【公開號】CN105385599
【申請?zhí)枴緾N201511009229
【發(fā)明人】葉峰, 王曉艷
【申請人】南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2016年1月21日