一種梅奇酵母菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物新資源及微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種梅奇酵母菌及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國桃園面積超過900萬畝，是世界上桃有效種植面積第一大國；年產(chǎn)桃超過40 萬噸，是世界上桃產(chǎn)量第一大國。北京桃產(chǎn)量位居國內(nèi)前8名，僅北京平谷一地，桃種植面 積就達(dá)22萬畝（1.47萬公頃）之多；桃產(chǎn)業(yè)已成為平谷縣的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)，一些桃子及相 關(guān)加工產(chǎn)品已經(jīng)出口到歐盟、日本等國家。2000年以來北京桃褐腐病大面積增加，且逐年加 重；其中2005年發(fā)病較重的桃園，桃果受害，大量脫落，采摘時未見顯癥的果實(shí)，在采摘2-3 天后，50%以上的果實(shí)因褐腐病侵染而腐爛，給果農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2012年北京市 植保站桃褐腐病調(diào)查結(jié)果顯示，北京各郊區(qū)縣桃產(chǎn)區(qū)均有桃褐腐病發(fā)生，而且桃子在采后 的運(yùn)輸和貯藏期間發(fā)病率都在30%以上；這大大降低了果實(shí)的食用價值和市場價值，嚴(yán)重 影響了北京桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003] 應(yīng)用殺菌劑防治采后病害是降低果品損失的重要手段，目前國內(nèi)應(yīng)用于果實(shí)采后 病害防治的化學(xué)藥劑主要為SO 2和噻苯咪唑（Thiabendazole)。SO 2的廣泛使用常常會帶來 環(huán)境污染，而且在常距離運(yùn)輸和長期的果實(shí)貯藏中，其殺菌效果會隨時間而迅速喪失；噻苯 咪唑雖然對果實(shí)采后真菌病害有較好的防治效果，但對病原細(xì)菌沒有效果，而且其使用后 殘效期較長，不易降解，會影響高端果品的對外出口；更重要的是，噻苯咪唑的大范圍應(yīng)用 容易使得一些病原菌產(chǎn)生抗藥性。生物殺菌劑相對于化學(xué)農(nóng)藥而言有天然優(yōu)勢，避免了農(nóng) 藥殘留、環(huán)境污染、抗藥性等問題，而且低毒、環(huán)保、持效，自然界生態(tài)兼容性較好，是化學(xué) 農(nóng)藥試劑應(yīng)用最有前景的替代手段之一。
[0004] 梅奇酵母菌屬酵母菌在自然環(huán)境中普遍存在，主要存在于含糖量較為豐富的果實(shí) 表面和花上，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢微生物種群之一。該菌生長速度快，營養(yǎng)簡單，生 長力強(qiáng)。在作為生防菌應(yīng)用方面，它擁有自己獨(dú)特的優(yōu)勢：1)對環(huán)境的污染較少，不產(chǎn)生毒 素；2)不產(chǎn)生抗生素，對人類相對比較安全；3)相對于其他真菌而言，不產(chǎn)生致敏孢子；4) 所需營養(yǎng)比較簡單；5)適合商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，它具有很好的應(yīng)用前景。
[0005] 本發(fā)明成功獲得了 一株抑制桃采后褐腐病菌及桃采后褐腐病的梅奇酵母菌，經(jīng)試 驗(yàn)驗(yàn)證，該酵母菌對桃褐腐病菌的抑菌圈直徑為IOmm以上，說明所述梅奇酵母菌具有穩(wěn) 定、高效的抗菌性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一新種梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)。
[0007] 本發(fā)明的目的也在于提供一種病原菌抑制劑，其活性成分為上述梅奇酵母菌和/ 或其的代謝物。
[0008] 本發(fā)明的目的也在于提供一種病害抑制劑，其活性成分為上述梅奇酵母菌和/或 其的代謝物。
[0009] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)，菌株號為QHL-12-3,其在中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 10463。
[0010] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.) QHL-12-3 的 5. 8S rDNA、ITS1/ITS2 基因序 列，26S rDNA基因序列分別如SEQ ID No. 1和No. 2所示。
[0011] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.) QHL-12-3的26S rDNA基因序列進(jìn)化樹分 析如圖1所示。
[0012] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3,從果實(shí)表面分離得到。
[0013] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的形態(tài)學(xué)特征為：菌體營養(yǎng)細(xì)胞 呈球形，卵形或近球形，單邊或多邊出芽生殖；20°C下，在Yro培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長 48小時后，菌落為奶油狀、乳白色不透明，扁平或圓形，邊緣整齊，菌落無褶皺，如圖2和圖3 所示。
[0014] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. )QHL-12-3的生理生化特征：可進(jìn)行葡萄 糖、麥芽糖弱發(fā)酵，不可進(jìn)行棉子糖、乳糖、蔗糖、半乳糖和海藻糖發(fā)酵；碳源同化方面：葡 萄糖、山梨糖、蔗糖、麥芽糖、蜜二糖、海藻糖、纖維二糖、木糖、核糖、松三糖、乙醇、葡萄糖 醇、丙三醇、甘露醇、核糖醇、水楊酸、氨基葡萄糖、十六烷和可溶性淀粉為陽性，菌粉、乳酸、 甲醇、肌醇、乳糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醇、赤蘚糖醇、檸檬酸為陰性。 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)QHL-12_3在含有5% (質(zhì)量含量）氯化鈉的培養(yǎng)基 中均可正常生長，于含有10% (質(zhì)量含量）氯化鈉的培養(yǎng)基中可生長；于pH 4. 0-5. 5的 培養(yǎng)基中均可正常生長，在環(huán)境溫度為4°C下生長勢弱，在40°C以上不可生長；最佳適宜生 長溫度為16_20°C ;在不含維生素的培養(yǎng)基上不能生長。所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.) QHL-12-3產(chǎn)生有機(jī)酸，這是生防菌的關(guān)鍵性生防指標(biāo)。
[0015] 本發(fā)明的目的還在于提供上述梅奇酵母菌和/或其代謝物在抑制病原菌、制備病 原菌抑制劑，抑制病害、制備病害抑制劑中的應(yīng)用。
[0016] 上述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的應(yīng)用中，所述病原菌為桃采后 褐腐病菌；所述病害為桃采后褐腐病。
[0017] 其中，所述桃米后褐腐病菌為 Monilinia fructicola、Monilinia Iaxa 或 Monilinia fructigena。
[0018] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的代謝物可從梅奇酵母菌 (Metschnikowia sp.)QHL-12_3 的發(fā)酵液中獲得。
[0019] 所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. )QHL-12_3的代謝物的制備方法為：將保 藏的梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.)從PDA固體斜面接種2環(huán)至200ml的YPD液體 培養(yǎng)基中，于20 °C -25 °C，150-200rpm條件下，恒溫振蕩培養(yǎng)24h-48h，得到梅奇酵母菌 (Metschnikowia sp.) QHL-12-3的發(fā)酵液；將培養(yǎng)好的發(fā)酵液，分裝于50ml的離心管中，在 4°C和5000rpm條件下，離心5-10min，上清液即梅奇酵母菌代謝物；
[0020] PDA固體培養(yǎng)基的主要成分：馬鈴薯：20%，葡萄糖：2%，瓊脂：2%，蒸餾水；
[0021] Yro液體培養(yǎng)基的主要成分為：酵母提取物：1%，葡萄糖：2%，胰蛋白胨：2%，蒸 餾水。
[0022] 本發(fā)明的有益效果為：獲得的梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3是一株 新的梅奇酵母菌菌株，它對桃采后褐腐病菌和桃采后褐腐病均具有抑制作用。在所選擇的 植物病原真菌中，對桃褐腐病菌的抑菌圈直徑達(dá)到IOmm以上，說明所述梅奇酵母菌具有穩(wěn) 定、高效的抗菌性能。所述的梅奇酵母菌及其代謝物可以在抑制桃褐腐病菌、制備桃褐腐病 菌制劑；抑制桃褐腐病害，制備桃褐腐病害制劑中應(yīng)用。
[0023] 生物材料保藏說明
[0024] 分類命名：梅奇酵母菌（Metschnikowia sp.);菌株編號：QHL-12-3
[0025] 保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0026] 保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC
[0027] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0028] 保藏日期：2015年01月30日
[0029] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 10463.
【附圖說明】
[0030] 圖1.基于26S rDNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹，進(jìn)化樹分析結(jié)果表明梅奇酵母菌 QHL-12-3代表的種為一獨(dú)立分支，梅奇酵母菌QHL-12-3為一新種。
[0031] 圖2.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在YH)培養(yǎng)基上生長3天后的 顯微照片。
[0032] 圖3.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在PDA培養(yǎng)基上生長3天后的 顯微照片。
[0033] 圖4.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在PDA培養(yǎng)基上對桃褐腐病菌 (Monilinia fructicola)的抑制效果。
[0034] 圖5.梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3在桃果實(shí)上對桃褐腐病斑的抑 制效果。
[0035] 圖6.所述梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3代謝物對桃果實(shí)上桃褐腐 病斑的抑制效果。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 下述實(shí)施例中所用到的病原菌，公眾可從野外采集，也可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲 得，以重復(fù)本申請實(shí)驗(yàn)：
[0039] 桃褐腐病菌--鏈核盤菌（Monilinia fructicola(wint. )Rehm)(王菲等.桃褐 腐病的發(fā)生與防治.果樹花卉.2012年第5期p58)。
[0040] 實(shí)施例1、梅奇酵母菌（Metschnikowia sp. ) QHL-12-3的分離與菌株鑒定
[0041] 1、樣品米集
[0042] 從中國青海省，采集野果。
[0043] 2、菌株的分離篩選及拮抗篩選
[0044] 從有機(jī)水果上分離菌株，采用常規(guī)梯度稀釋涂布分離，用PDA (含硫酸鏈霉素）和 Yro瓊脂（含硫酸鏈霉素）2種培養(yǎng)基分別在25°C條件下培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)差異較大并可 純培養(yǎng)的菌株，在Yro瓊脂培養(yǎng)基上純化保存，并以桃褐腐病菌為靶標(biāo)病原菌進(jìn)行拮抗菌 的初篩和多次復(fù)篩，最終得到一株抑菌活性強(qiáng)的類酵母菌菌株，命名其為QHL-12-3。
[0045] 3、菌株的鑒定
[0046] 對菌株QHL-12-3進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性和部分保守序列的分析。參考 ((The Yeasts, a Taxonomic Study)) (Kurtzman, C. P. (1998a). ffilliopsis Zender. In The Yeasts, a Tax