米曲霉原生質體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種米曲霉原生質體制備方法，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002]米曲霉是一種好氣性真菌，屬于半知菌亞門、曲霉屬，其菌絲一般呈黃綠色，產孢量大且含多核，其生長周期中缺乏有性生殖過程。米曲霉是一類能生產復合酶的菌株，生產的酶類包括纖維素酶、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等，因此米曲霉在釀造、飼料、食品等工業(yè)領域占據非常重要的地位，其中包括在米酒、醬油、商業(yè)酶以及醫(yī)用蛋白生產中應用十分廣泛。另外，米曲霉具有高效的蛋白分泌表達能力，其異源蛋白表達水平與真核蛋白的優(yōu)秀表達系統(tǒng)畢赤酵母的表達水平相當。1989年美國食品與藥品管理局(FDA)和美國飼料公司協(xié)會公布米曲霉是一種安全的微生物菌種(Generally Recognized as Safe foodingredients’GRAS級)。以米曲霉為生產菌株，已具有成熟的發(fā)酵及后處理技術，因此常作為基因表達、蛋白分泌研究和異源蛋白表達的理想對象。在實際生產中，米曲霉的產酶能力往往欠佳。如果能對米曲霉進行人工改造以提高其酶活，將會在一定程度上提高生產效率，降低成本；利用基因工程技術，構建米曲霉遺傳轉化系統(tǒng)如基因工程菌株和高效的外源蛋白表達系統(tǒng)的研究日益受到重。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種米曲霉原生質體的制備方法，本發(fā)明方法原生質體產量高、再生率高，為進一步處理提供了良好的條件。
[0004]具體技術方案如下:
[0005]米曲霉原生質體的制備方法，步驟如下:
[0006]1)將107個米曲霉孢子接種于液體培養(yǎng)基中，于30°C充分震蕩培養(yǎng)20小時；液體培養(yǎng)基為G-P培養(yǎng)基，其組分為:蛋白胨1 %，葡萄糖0.5 %，磷酸二氫鉀0.5 %，硝酸鈉0.1%,硫酸鎂0.05%，余量為水；
[0007]2)用擦鏡紙過濾收集菌絲，用滅菌水清洗菌絲并將菌絲水分除去；
[0008]3)將菌絲放入酶液中，酶解2-4個小時；
[0009]所述酶液配制:每取蝸牛酶lg及Yatalase裂解酶0.8g,以0.8mol/L氯化鈉為溶劑，調pH6.0定容至100mL，混勻備用；
[0010]4)收集原生質體。
[0011]步驟3)酶解時間為3個小時。
[0012]米曲霉培養(yǎng)可以先采用PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，在超凈工作臺上用生理鹽水收集孢子并計數。取107個米曲霉孢子接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝液量為50mL/250mL, 28°C，200轉/分，振蕩培養(yǎng)20h，收集菌絲。
[0013]有益效果:
[0014]采用本發(fā)明方法，原生質體產量可達1.5X107個/mL，，并且再生率可達90%。本發(fā)明制備的米曲霉菌株改造奠定了技術基礎。
【附圖說明】
[0015]圖1培養(yǎng)基對原生質體產量的影響
[0016]圖2酶液對原生質體產量的影響
[0017]圖3 pH對原生質體產量的影響
[0018]圖4酶解時間對原生質體產量的影響
[0019]圖5滲透劑種類對原生質體產量的影響。
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021]將107個米曲霉孢子接種于G-P液體培養(yǎng)基(蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硝酸鈉0.1%，硫酸鎂0.05% )中，于30°C充分震蕩培養(yǎng)20小時后，用四層擦鏡紙過濾培養(yǎng)基，并用滅菌水沖洗滯留在擦鏡紙上的菌絲，于無菌的環(huán)境中取菌絲2g，加入10mL酶液(蝸牛酶1%，Yatalase裂解酶0.8% )中，酶解時間為3h，鏡檢計數，收集。
[0022]酶液(蝸牛酶1%，Yatalase裂解酶0.8% )配制:取蝸牛酶lg及Yatalase裂解酶0.8g,以0.8mol/L氯化鈉為溶劑，調ρΗ6.0定容至lOOmL，混勻備用。0.8mol/L氯化鈉也為滲透劑。
[0023]由鏡檢計數可知，當酶解3h時，原生質體的產量可達1.5X 107個/mL，并且再生率可達90%。
[0024]實施例2
[0025]將107個米曲霉孢子分別接種于土豆汁培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、G-P培養(yǎng)基(蛋白胨1 %，葡萄糖0.5 %，磷酸二氫鉀0.5 %，硝酸鈉0.1 %，硫酸鎂0.05 % )、YPD培養(yǎng)基(葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1 % )中，每個培養(yǎng)基三個平行，于30°C充分震蕩培養(yǎng)20小時后，用四層擦鏡紙過濾培養(yǎng)基，并用滅菌水沖洗滯留在擦鏡紙上的菌絲，于無菌的環(huán)境中取菌絲2g，，放入以lmol/山梨醇作滲透劑的酶液(蝸牛酶1%)中，結果如圖1所示。
[0026]由圖1可知，不同的培養(yǎng)基對菌絲的生長有影響，當培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時菌絲生長較快，細胞壁較厚，從而影響酶解效果。由圖1數據可知，當用G-P培養(yǎng)基時，原生質體的產量較高，可達6.0X 105個/mL，而用其他培養(yǎng)基時原生質體相對較少。
[0027]實施例3
[0028]取在G-P液體培養(yǎng)基中30°C充分震蕩培養(yǎng)20h的米曲霉菌絲2g，以lmol/山梨醇作滲透劑，取培養(yǎng)20h的菌絲，放入以1M山梨醇作滲透劑及溶劑的酶液中，做三個平行，酶解3h。
[0029]酶液:1M山梨醇為溶劑，分別配成1 %蝸牛酶與0，0.1 %，0.2 %，0.3 %，
0.4% ,0.5%,0.6% ,0.7%,0.8% ,0.9%,1% , 1.1%,1.2% Yatalase 裂解酶的混合酶液。結果如圖2所示。
[0030]由圖2可知向1%蝸牛酶中加入Yatalase裂解酶的量對原生質體的制備有影響，當加入Yatalase裂解酶的量為0.8%時，原生質體的質量達4.2X 106個/mL，而加入Yatalase裂解酶的量< 0.8%或> 0.8%時，原生質體數量相對較少。
[0031]實施例4
[0032]取在G-P液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h的米曲霉菌絲2g，以lmol/山梨醇作滲透劑，用HC1和NaOH調節(jié)pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，每個pH三個平行，酶解條件如實施例1，
結果如圖2所不。
[0033]由圖3可知pH對原生質體的制備有影響，pH影響酶的活性，當pH 6.0時，原生質體的質量可達6.4X 106個/mL，而pH < 5.5或> 6.5時原生質體數量相對減少。
[0034]實施例5
[0035]取在G-P液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h的米曲霉菌絲2g，以lmol/山梨醇作滲透劑，pH
6.0，酶解時間分別為lh，2h, 3h, 4h, 5h每個時間三個平行，其余條件如實施例1，結果如圖
3所示。
[0036]由圖4可知，酶解時間對原生質體產量影響顯著，當酶解時間在2?4h時，原生質體產量都可以達到3.4X 106個/mL，酶解時間為3h時，原生質體的數量可達7.5X 10 6個/mL,而其他酶解時間原生質體相對較少。
[0037]實施例6
[0038]選取0.8mol/L山梨醇，氯化鉀，氯化鈉，硫酸鎂溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑，每個穩(wěn)定劑三個平行，取培養(yǎng)20h的米曲霉菌絲2g，30°C水浴酶解3h，其余條件如實施例1，鏡檢計數。
[0039]原生質體在低滲溶液中容易吸水漲破，所以選用特定的高滲溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑以維持原生質體形態(tài)，由圖5可知，用氯化鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑，原生質體的產量相對較高，數量可達9.0 X106個/mL。
【主權項】
1.米曲霉原生質體的制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)將107個米曲霉孢子接種于液體培養(yǎng)基中，于30°C充分震蕩培養(yǎng)20小時；液體培養(yǎng)基為G-P培養(yǎng)基，其組分為:蛋白胨1 %，葡萄糖0.5%，磷酸二氫鉀0.5%，硝酸鈉0.1 %，硫酸鎂0.05%，余量為水； 2)用擦鏡紙過濾收集菌絲，用滅菌水清洗菌絲并將菌絲水分除去； 3)將菌絲放入酶液中，酶解2-4個小時； 所述酶液配制:每取蝸牛酶lg及Yatalase裂解酶0.8g,以0.8mol/L氯化鈉為溶劑，調pH6.0定容至100mL，混勻備用； 4)收集原生質體。2.根據權利要求書1所述方法，其特征在于:步驟3)酶解時間為3個小時。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種絲狀真菌米曲霉原生質體的制備方法，涉及生物工程中原生質體制備的方法技術領域。該方法包括：米曲霉的培養(yǎng)，收集菌絲、酶解等。采用本發(fā)明方法，原生質體產量可達1.5×107個/mL，并且再生率可達90％，對米曲霉基因改造奠定了基礎。
【IPC分類】C12N1/06, C12N1/14, C12R1/69
【公開號】CN105385610
【申請?zhí)枴緾N201511004097
【發(fā)明人】曾斌, 郝慶, 劉華
【申請人】江西科技師范大學
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年12月29日