尼羅羅非魚種質(zhì)純度鑒定用引物及pcr鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測鑒定技術(shù)，具體的說涉及對尼羅羅非魚種質(zhì)純度進(jìn)行PCR鑒定的引物及使用該引物的PCR鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]尼羅羅非魚屬于鱸形目，麗魚科，羅非魚屬，原產(chǎn)于約旦的坦噶尼喀湖，我國于1978年從泰國引進(jìn)并推廣養(yǎng)殖，現(xiàn)在我國已是世界上最大的羅非魚生產(chǎn)國和出口國。我國主要養(yǎng)殖的羅非魚品種有尼羅羅非魚，奧利亞羅非魚和奧尼雜交羅非魚等。由于不同品種的羅非魚有很大的形態(tài)特征重疊，這使僅從形態(tài)上鑒別不同羅非魚品種非常困難。另外，羅非魚品種間很容易雜交，且雜交種可育，雜交種形態(tài)又與親本性狀很相似，因此，很容易造成羅非魚種質(zhì)混雜，導(dǎo)致優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀退化，這也是目前制約我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的突出問題。在養(yǎng)殖過程中雌雄羅非魚生長差異明顯，雄魚比雌魚生長快，常常導(dǎo)致出池規(guī)格相差懸殊，從而降低了商品魚的質(zhì)量，減少了經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]解決的技術(shù)問題:為了快速、準(zhǔn)確鑒定尼羅羅非魚種質(zhì)純度，防止優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀退化，本發(fā)明提供一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度鑒定用引物及PCR鑒定方法。
[0004]技術(shù)方案:一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定用引物，所述引物能夠?qū)δ崃_羅非魚的MyoD基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成一條長度為229bp的特異性擴(kuò)增片段。
[0005]MyoD基因是成肌分化抗原基因Myogenic Differentiat1n Antigen的縮寫，其在Gene bank數(shù)據(jù)庫中的序列號為:⑶246722。
[0006]優(yōu)選的，所述鑒定用引物的核苷酸序列為:
[0007]正向:5，-CATGGTGAGTTCAAGGAGCAC-3，
[0008]反向:5，-GAGAAAGTTACACACACAGGCAGCT-3，。
[0009]一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定方法，該方法以尼羅羅非魚血液樣品中提取的基因組DNA為模板，采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。
[0010]優(yōu)選的，所述鑒定方法中的PCR的反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)MIX液5 yL，正反向引物各0.25 μ L，50ng/ μ L?lOOng/ μ L的DNA模板1 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μ L。
[0011]優(yōu)選的，所述鑒定方法中的PCR的反應(yīng)程序為:預(yù)變性94°C、2min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。
[0012]—種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定用試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的引物。
[0013]有益效果:(1)使用本發(fā)明的引物對尼羅羅非魚的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，生成一條229bp的特異性擴(kuò)增片段，與奧利亞羅非魚的1條264bp條帶，奧尼羅非魚的2條分別為229bp和264bp的條帶，能夠明顯區(qū)分，因而可以簡單、精確地對尼羅羅非魚的種質(zhì)純度進(jìn)行鑒定；(2)本發(fā)明所述引物特異性強(qiáng)，不會對目標(biāo)片段以外的其它片段擴(kuò)增；(3)本發(fā)明公開了使用所述引物的PCR鑒定方法，該方法操作快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，避免了采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定不同品種的羅非魚帶來的結(jié)果不穩(wěn)定的缺陷。
【附圖說明】
[0014]圖1是尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚及奧尼羅非魚種質(zhì)鑒定結(jié)果；
[0015]其中，Μ為DL1000 ;1_3、11，12，17-19為尼羅羅非魚；4，7為奧利亞羅非魚；5,6,8, 10，13-16:奧尼羅非魚；
[0016]圖2是純種尼羅羅非魚種質(zhì)鑒定結(jié)果；
[0017]其中，Μ為DL1000 ;1-23為尼羅羅非魚。
【具體實施方式】
[0018]以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0019]實施例1
[0020]第1步、引物設(shè)計
[0021]根據(jù)尼羅羅非魚的MyoD基因序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計引物，引物序列為:
[0022]正向:5’-CATGGTGAGTTCAAGGAGCAC-3’
[0023]反向:5’-GAGAAAGTTACACACACAGGCAGCT-3’。
[0024]第2步、基因組DNA提取
[0025](1)取待檢樣品19尾，樣品均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場米得;
[0026](2)尾靜脈采血，使用Axygen生產(chǎn)的AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒，并按照說明書步驟抽提基因組DNA。
[0027]第3步、PCR鑒定方法建立
[0028](l)PCR的反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)MIX液5 μ L，正反向引物各0.25 μ L，DNA模板1 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μ L ;
[0029](2)PCR的反應(yīng)程序為:預(yù)變性94°C、2min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存；
[0030](3)PCR反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，采用凝膠成像儀拍照記錄電泳結(jié)果。
[0031]如圖1所示，電泳檢測發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚都只有1條229bp的條帶；奧利亞羅非魚都只有1條264bp的條帶；奧尼羅非魚有2條條帶，1條為229bp，另1條為264bp，由電泳圖譜可將尼羅羅非魚、奧利亞羅非魚以及奧尼羅非魚區(qū)別開來。
[0032]從圖中可知，采用本發(fā)明所述的尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定用引物擴(kuò)增基因組DNA時，無其他雜帶出現(xiàn)，因此本發(fā)明設(shè)計的引物能夠特異性的擴(kuò)增目標(biāo)序列。
[0033]實施例2
[0034]采用實施例1所述步驟鑒定尼羅羅非魚的種質(zhì)純度。其中，待檢尼羅羅非魚23尾，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興漁場采得。如圖2所示，電泳檢測發(fā)現(xiàn)，23尾待檢魚均有1條229bp條帶，均為純種尼羅羅非魚。
【主權(quán)項】
1.一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定用引物，其特征在于，所述引物能夠?qū)δ崃_羅非魚的MyoD基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成一條長度為229bp的特異性擴(kuò)增片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定用引物，其特征在于，引物的核苷酸序列為:正向:5’ -CATGGTGAGTTCAAGGAGCAC-3’反向:5’ -GAGAAAGTTACACACACAGGCAGCT-3’。3.權(quán)利要求1或2所述的一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定方法，其特征在于，該方法以尼羅羅非魚血液樣品中提取的基因組DNA為模板，采用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定方法，其特征在于，PCR的反應(yīng)體系為:10X反應(yīng)MIX液5 μ L，正反向引物各0.25yL，濃度為50ng/yL?100ng/yL的DNA模板1 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至10 μ Lo5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定方法，其特征在于，PCR的反應(yīng)程序為:預(yù)變性94°C、2min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保存。6.一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度PCR鑒定用試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的引物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種尼羅羅非魚種質(zhì)純度鑒定用引物及PCR鑒定方法，所述引物能夠?qū)δ崃_羅非魚的MyoD基因進(jìn)行擴(kuò)增，生成一條229bp的特異性擴(kuò)增片段。(1)使用本發(fā)明的引物對尼羅羅非魚的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，生成一條229bp的特異性擴(kuò)增片段，與奧利亞羅非魚的1條264bp條帶，奧尼羅非魚的2條分別為229bp和264bp的條帶，能夠明顯區(qū)分，因而可以簡單、精確地對尼羅羅非魚的種質(zhì)純度進(jìn)行鑒定；(2)本發(fā)明所述引物特異性強(qiáng)，不會對目標(biāo)片段以外的其它片段擴(kuò)增；(3)本發(fā)明公開了使用所述引物的PCR鑒定方法，該方法操作快捷、結(jié)果準(zhǔn)確，避免了采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法鑒定不同品種的羅非魚帶來的結(jié)果不穩(wěn)定的缺陷。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105385759
【申請?zhí)枴緾N201510853041
【發(fā)明人】李紅霞, 俞菊華, 唐永凱, 李建林, 于凡, 何杰
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
【公開日】2016年3月9日
【申請日】2015年11月30日