用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)與小麥抗旱的引物及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物為由引物對(duì)A和引物對(duì)B組成的引物對(duì)組：所述引物對(duì)A為由序列表中序列1所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)B為由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)。利用本發(fā)明所提供的引物檢測(cè)小麥抗旱性，方法可靠、簡(jiǎn)便、實(shí)用，在小麥種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和育種標(biāo)記的輔助選擇中具有重要應(yīng)用前景，同時(shí)為培育抗旱性強(qiáng)的小麥品種提供了參考依據(jù)。
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小麥?zhǔn)俏覈?guó)的重要的糧食作物和重要的戰(zhàn)略性儲(chǔ)備糧食品種。在各種逆境因子中，干旱已成為限制小麥生產(chǎn)的最主要因子，選育和推廣抗旱小麥品種是解決這一難題既經(jīng)濟(jì)又有效的途徑之一。尋找與其編碼基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可為分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。
[0003]植物在受到水分脅迫后，會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列生理、生化反應(yīng)以應(yīng)對(duì)水分匱缺。脅迫壓力作為信號(hào)可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)，進(jìn)而促使蛋白質(zhì)的組成發(fā)生改變，或者合成新的蛋白質(zhì)，由于蛋白質(zhì)直接參與植物的應(yīng)激反應(yīng)，研究水分脅迫誘導(dǎo)蛋白有助于了解蛋白質(zhì)與植物適應(yīng)環(huán)境壓力之間的關(guān)系。Schuppler等通過(guò)輕度水分脅迫處理小麥幼苗,發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)分子量34kDa的 蛋白含量明顯增加。石峰等研究18份小麥品種水分脅迫誘導(dǎo)蛋白與抗旱性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)小麥在水分脅迫后能夠引起分子量約66.2KDa應(yīng)答蛋白的特異表達(dá)，該蛋白在中等及以上抗旱性品種中均有表達(dá)，而在弱抗旱性品種中不表達(dá)。在此研究的基礎(chǔ)上，張潔等研究了 30份冬小麥品種(系)幼苗期水分脅迫后葉片中應(yīng)答蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與品種的抗旱性緊密相關(guān)，并提出此蛋白在水分脅迫下的表達(dá)可作為鑒定品種抗旱性的一項(xiàng)指標(biāo)。任萬(wàn)杰等對(duì)150份不同水旱生態(tài)型的冬小麥品種(系)進(jìn)行不同水分條件下的應(yīng)答蛋白表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白表達(dá)的類型與品種水旱生態(tài)型間呈極顯著相關(guān)。王婧等利用SSR標(biāo)記對(duì)雜交組合(邯鄲6050 X西農(nóng)2208) F2群體進(jìn)行分析，對(duì)該應(yīng)答蛋白基因進(jìn)行了初步定位，命名為“RpDD”，獲得了位于同一側(cè)且距離較遠(yuǎn)的兩個(gè)SSR標(biāo)記Xgwml29和Xgwm304o

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)小麥抗旱的引物及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物，為由如下引物對(duì)A和引物對(duì)B組成的引物對(duì)組:
[0006]所述引物對(duì)A具體為由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)B為由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)。
[0007]在實(shí)際應(yīng)用中，所述引物對(duì)組(序列1、序列2、序列3和序列4)中的四條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1:1:1:1。
[0008]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在所述引物對(duì)組中，組成每個(gè)引物對(duì)的兩條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的工作濃度均為0.25 μ M0
[0009]含有所述引物對(duì)組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]所述引物對(duì)組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0011]所述引物對(duì)組的制備方法可包括將所述引物對(duì)組中各序列所示單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
[0012]所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]所述試劑盒的制備方法可包括如下步驟:將所述引物對(duì)組中各序列所示單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)=PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
[0014]其中，序列I由25個(gè)核苷酸組成；序列2由25個(gè)核苷酸組成；序列3由20個(gè)核苷酸組成；序列4由20個(gè)核苷酸組成。
[0015]所述引物對(duì)組在檢測(cè)小麥抗旱性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)小麥抗旱性的方法。
[0017]本發(fā)明所提供的檢測(cè)小麥抗旱性的方法，可為如下(a) - (C)中任一種:
[0018](a)具體可包括如下(al)- (a2)步驟:
[0019](al)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以由所述引物對(duì)A (由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0020](a2)檢測(cè)步驟(al)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性強(qiáng)的小麥或候選為抗旱性強(qiáng)的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
[0021](b)具體可包括如下(bl)_ (b2)步驟:
[0022](bl)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以由所述引物對(duì)B (由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對(duì))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0023](b2)檢測(cè)步驟(bl)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性強(qiáng)的小麥或候選為抗旱性強(qiáng)的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
[0024](C)具體可包括如下(Cl)- (c2)步驟:
[0025](cl)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以所述引物對(duì)A (由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì))和所述引物對(duì)B (由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對(duì))分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0026](c2)檢測(cè)步驟(Cl)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)小麥的抗旱性:若采用所述引物對(duì)A擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，且采用所述引物對(duì)B擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性強(qiáng)的小麥或候選為抗旱性強(qiáng)的小麥；若采用所述引物對(duì)A擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，且采用所述引物對(duì)B擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
[0027]在實(shí)際應(yīng)用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有目的DNA片段時(shí)，可通過(guò)將PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(凝膠濃度具體可如6%)，看電泳圖譜上是否含有目的條帶:電泳圖譜上含有目的條帶，則PCR產(chǎn)物中含有目的DNA片段。
[0028]在上述方法中，所述大小為IOlbp的DNA片段具體為序列表中序列5所示DNA片段；所述大小為117bp的DNA片段具體為序列表中序列6所示DNA片段；所述大小為215bp的DNA片段具體為序列表中序列7所示DNA片段；所述大小為219bp的DNA片段具體為序列表中序列8所示DNA片段。
[0029]在實(shí)際應(yīng)用中，判斷PCR產(chǎn)物中是否含有含有序列5-序列8中任一所示DNA片段，可通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定來(lái)判斷。
[0030]在上述方法中，以所述引物對(duì)A(由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì))進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為53°C;以所述引物對(duì)B (由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對(duì))進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度具體可為53°C。
[0031]所述引物對(duì)組，或所述方法在如下(I)- (IV)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0032](I)篩選抗旱性強(qiáng)的小麥品種；
[0033](II)篩選抗旱性弱的小麥品種；
[0034](III)培育抗旱性強(qiáng)的小麥品種；
[0035](IV)培育抗旱性弱的小麥品種。
[0036]本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種培育抗旱性強(qiáng)(或弱)的小麥品種的方法，包括采用通過(guò)以上所述方法檢測(cè)得到的所述抗旱性強(qiáng)(或弱)的小麥品種作為親本進(jìn)行育種的步驟。
[0037]在本發(fā)明中，所有的所述抗旱性均主要體現(xiàn)為小麥全生育期的抗旱性，具體體現(xiàn)在小麥抗旱指數(shù)上。
[0038]在本發(fā)明中，所有所述抗旱性強(qiáng)的小麥均為抗旱指數(shù)在1.10以上的小麥；所有所述抗旱性弱的小麥均為抗旱指數(shù)在0.89以下的小麥。具體的，所述抗旱指數(shù)均為按照“小麥抗旱性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”中“全生育期抗旱性鑒定”中記載的方法及公式計(jì)算所得。更加具體而言，在本發(fā)明中，所有所述抗旱性強(qiáng)的小麥均為“小麥抗旱性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”中記載的小麥全生育期抗旱性等級(jí)高于中等(抗旱性等級(jí)為極強(qiáng)或強(qiáng))的小麥；所有所述抗旱性弱的小麥均為“小麥抗旱性鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范(GB/T21127-2007)”中記載的小麥全生育期抗旱性等級(jí)低于中等(抗旱性等級(jí)為極弱或弱)的小麥。
[0039]本發(fā)明對(duì)65份小麥品種的統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用引物對(duì)Xbarc56擴(kuò)增出IOlbp目的條帶(序列5)，且采用引物對(duì)Xbarcll7擴(kuò)增出215bp目的條帶(序列7)的小麥品種中，有88.9%為抗旱性強(qiáng)的小麥品種；采用引物對(duì)Xbarc56擴(kuò)增出117bp目的條帶(序列6)，且采用引物對(duì)Xbarc117擴(kuò)增出219bp目的條帶(序列8)的小麥品種中，有90.9%為抗旱性弱的小麥品種?？梢?jiàn)，本發(fā)明所提供的檢測(cè)小麥抗旱性的方法可靠、簡(jiǎn)便、實(shí)用，在小麥種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和育種標(biāo)記的輔助選擇中具有重要應(yīng)用前景，同時(shí)為培育抗旱性強(qiáng)的小麥品種提供了參考依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0040]圖1為引物對(duì)Xbarc56和引物對(duì)Xbarcll7分別對(duì)不同抗旱性等級(jí)的小麥品種(系)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。其中，A為引物對(duì)Xbarc56的擴(kuò)增結(jié)果；B為引物對(duì)Xbarcl 17的擴(kuò)增結(jié)果；A和B中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，各條帶由大到小依次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp ;泳道I為晉麥47 ;泳道2為西農(nóng)2208 ;泳道3為長(zhǎng)旱58 ;泳道4為西
27;泳道5為CK6004 ;泳道6為臨旱917 ;泳道7為運(yùn)旱21-30 ;泳道8為晉麥50 ;泳道9為普冰143 ;泳道10為中梁88375 ;泳道11為洛旱2號(hào)；泳道12為石家莊8號(hào)；泳道13為秦麥I號(hào)；泳道14為滄核030 ;泳道15為川96003 ;泳道16為1424 ;泳道17為長(zhǎng)武134 ;泳道18為西農(nóng)979 ;泳道19為濟(jì)麥20 ;泳道20為泰山9818 ;泳道21為鄭麥9023 ;泳道22為德麥3號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0041 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0042]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043]下述實(shí)施例中所涉及的65份小麥品種(系)均為市面常售品種。
[0044]實(shí)施例1、用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物的獲得及其應(yīng)用
[0045]一、小麥抗旱性的測(cè)定
[0046]以表2中65份小麥品種(系)作為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定小麥品種(系)全生育期的相對(duì)發(fā)芽率，并進(jìn)行抗旱性等級(jí)的劃分。具體如下:
[0047]1、全生育期抗旱性鑒定
[0048](I)田間鑒定
[0049]在常年自然降雨量小于500mm的地區(qū)或小麥生育期內(nèi)自然降雨量小于150mm的地區(qū)進(jìn)行田間抗旱性鑒定。
[0050](a)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0051]隨機(jī)排列，三次重復(fù)，小區(qū)面積6.7m2。
[0052](b)脅迫處理
[0053]播種前表土墑情應(yīng)保證出苗，表墑不足時(shí)，要適量灌水。
[0054](C)對(duì)照處理
[0055]在鄰近脅迫處理的試驗(yàn)地設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)。對(duì)照試驗(yàn)地的土壤養(yǎng)分含量、土壤質(zhì)地和土層厚度等與脅迫處理的基本一致。田間水分管理要保證小麥全生育期處于水分適宜的狀況，播種前表土墑情應(yīng)保證出苗，表墑不足時(shí)，要適量灌水，另外，分別在拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期灌水，使Ocm-50cm 土層水分達(dá)到田間持水量的80%±5%。
[0056](2)考察性狀
[0057]小區(qū)籽粒產(chǎn)量。
[0058](3)抗旱指數(shù)
[0059]以小區(qū)籽粒產(chǎn)量計(jì)算抗旱指數(shù)，公式如下:
[0060]DI=YdX (Yd/Yp)/Yffld=(YdAp) X (Yd/Ymd)式⑴
[0061]式中，DI——抗旱指數(shù)；
[0062]Yd 脅迫環(huán)境品種(系)廣量；
[0063]Yp——非脅迫環(huán)境品種(系)產(chǎn)量；
[0064]Yffld—所有參試品種(系)于脅迫環(huán)境的平均產(chǎn)量；
[0065]注意:在進(jìn)行抗旱性鑒定期間，要及時(shí)防治病、蟲(chóng)、鳥(niǎo)害，防治倒伏。
[0066]2、小麥全生育期抗旱性判定[0067]抗旱性分為五級(jí):極強(qiáng)(HR,highly resistant)、強(qiáng)(R, resistant)、中等(MR,moderately resistant)、尋層(S，susceptible)、豐及尋層(HS，highly susceptible)。
[0068]具體的小麥全生育期抗旱性判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表I。
[0069]表I小麥全生育期抗旱性判定標(biāo)準(zhǔn)
[0070]
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)小麥抗旱性的引物對(duì)組，由如下引物對(duì)A和引物對(duì)B組成: 所述引物對(duì)A為由序列表中序列I所示的單鏈DNA和序列2所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)；所述引物對(duì)B為由序列表中序列3所示的單鏈DNA和序列4所示的單鏈DNA組成的引物對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)組，其特征在于:所述引物對(duì)組中的四條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1:1:1:1。
3.權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)組在檢測(cè)小麥抗旱性中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)小麥抗旱性的方法,為如下(a) - (c)中任一種: (a)包括如下(al)- (a2)步驟: (al)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2中所述的引物對(duì)A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物； (a2)檢測(cè)步驟(al)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性強(qiáng)的小麥或候選為抗旱性強(qiáng)的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥； (b)包括如下(bl)-(b2)步驟: (bl)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2中所述的引物對(duì)B進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物； (b2)檢測(cè)步驟(bl)所得PCR產(chǎn)`物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)小麥的抗旱性:若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性強(qiáng)的小麥或候選為抗旱性強(qiáng)的小麥；若所述PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥； (c)包括如下(cl)- (c2)步驟: (cl)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求1或2中所述的引物對(duì)A和所述的引物對(duì)B分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物； (c2)檢測(cè)步驟(Cl)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)小麥的抗旱性:若采用所述引物對(duì)A擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為IOlbp的DNA片段，且采用所述引物對(duì)B擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為215bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性強(qiáng)的小麥或候選為抗旱性強(qiáng)的小麥；若采用所述引物對(duì)A擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為117bp的DNA片段，且采用所述引物對(duì)B擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物中含有大小為219bp的DNA片段，則所述待測(cè)小麥為抗旱性弱的小麥或候選為抗旱性弱的小麥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述大小為IOlbp的DNA片段為序列表中序列5所示DNA片段；所述大小為117bp的DNA片段為序列表中序列6所示DNA片段；所述大小為215bp的DNA片段為序列表中序列7所示DNA片段；所述大小為219bp的DNA片段為序列表中序列8所示DNA片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于:以所述引物對(duì)A進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度為53°C ；以所述引物對(duì)B進(jìn)行PCR擴(kuò)增的退火溫度為53°C。
7.權(quán)利要求1-6中任一所述的引物對(duì)組或方法在如下(I)- (IV)中的應(yīng)用: (I)篩選抗旱性強(qiáng)的小麥品種；(II)篩選抗旱性弱的小麥品種； (III)培育抗旱性強(qiáng)的小麥品種； (IV)培育抗旱性弱的小麥品種。
8.培育抗旱性強(qiáng)的小麥品種的方法，包括采用通過(guò)權(quán)利要求4-6中任一所述方法檢測(cè)得到的所述抗旱性強(qiáng)的小麥品種作為親本進(jìn)行育種的步驟。
9.培育抗旱性弱的小麥品種的方法，包括采用通過(guò)權(quán)利要求4-6中任一所述方法檢測(cè)得到的所述抗旱性 弱的小麥品種作為親本進(jìn)行育種的步驟。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451286SQ201310381510
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】陳東升, 張曉科, 王憲國(guó), 張維軍, 亢玲, 金秀峰, 王小亮, 何進(jìn)尚 申請(qǐng)人:寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所