一種剛地弓形蟲蟲株的分離方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于剛地弓形蟲疫苗研究領(lǐng)域的新技術(shù)，具體就是一種從動物組織樣本有效獲得到剛地弓形蟲蟲株的分離方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能寄生在除紅細(xì)胞外的所有有核細(xì)胞內(nèi)，隨血液和淋巴液擴(kuò)散至全身各部位。中間宿主廣泛且無特異性，終末宿主僅限于貓或貓科動物。弓形蟲病是一種危害巨大的人畜共患疾病，在中國屬二類動物疫病。
[0003]弓形蟲作為重要的機(jī)會性致病原蟲，正常人和動物感染弓形蟲后多呈隱性感染，一般不引起明顯癥狀，但可在體內(nèi)長期潛伏，但如果發(fā)生在胎兒、機(jī)體免疫功能受損或缺陷的患者(如器官移植、艾滋病及惡性腫瘤患者等)，潛伏感染可以被激活，從而引起嚴(yán)重的甚至危及生命的疾病，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。弓形蟲病是人畜先天性疾病和流產(chǎn)的原因之一，還可引起腦炎和視網(wǎng)膜炎等。
[0004]弓形蟲病的預(yù)防和治療至今沒有找到有效地途徑，弓形蟲新型疫苗的研究被認(rèn)為是最有前景的防治措施，能夠有效獲得大量的弓形蟲分離株，這是弓形蟲疫苗研究取得進(jìn)一步突破的最有效如提。
[0005]由于弓形蟲遺傳的多樣性以及其分布的地域性差異較大，傳統(tǒng)的弓形蟲蟲株分離技術(shù)程序繁瑣、投入成本較高，分離效果較差。目前的分離弓形蟲方法，是采用組織研磨，然后將研磨液腹腔注射小鼠的方法；該方法有2個主要問題，接種的組織體積有限；小鼠易死亡。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是根據(jù)剛地弓形蟲的生活史特點及其在昆明小鼠體內(nèi)繁殖的特點，提供一套從剛地弓形蟲陽性的動物機(jī)體通過接種昆明小鼠有效分離獲得剛地弓形蟲的蟲株的便于操作，低成本的剛地弓形蟲蟲株的分離方法:
本發(fā)明的技術(shù)方案是以下述方式實現(xiàn)的:
1、一種剛地弓形蟲蟲株的分離方法，包括以下步驟:A、弓形蟲陽性動物樣品的獲得，B、弓形蟲陽性動物心肌消化液的獲得，C、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動物心肌消化液，D、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動物心肌消化液，E、接種后昆明小鼠的階段性護(hù)理，F(xiàn)、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測；其中:
A、弓形蟲陽性動物樣品的獲得
針對弓形蟲病流行區(qū)域的動物進(jìn)行采血，將采集的血液離心獲得動物血清，采用弓形蟲檢測試劑對血清弓形蟲抗體進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果為陽性的動物個體標(biāo)記為弓形蟲抗體陽性動物，并摘取該陽性動物的心臟、肌肉、大腦，隨機(jī)選取三個部位剪取心臟、肌肉、大腦，三部位總重至少為50克，即獲得的弓形蟲陽性動物心肌樣品；
B、弓形蟲陽性動物心肌消化液的獲得:
(1)用剪刀將弓形蟲陽性動物心肌剪碎；
(2)弓形蟲陽性動物心肌勻漿:將剪碎后的弓形蟲陽性動物心肌置于勻漿機(jī)內(nèi)，加入生理鹽水勻漿后倒出勻漿液，再用生理鹽水沖洗勻漿機(jī)，勻漿液和沖洗液合為一體為弓形蟲陽性動物心肌勻漿液，并用廣口瓶盛放并貼上標(biāo)簽，體積之比為:弓形蟲陽性動物心肌:生理鹽水=1:5 ；
(3 )胃蛋白酶消化:向弓形蟲陽性動物心肌勻漿液內(nèi)加入胃蛋白酶溶液，加入量按體積比為:弓形蟲陽性動物心肌:胃蛋白酶溶液=1:5 ;將加入胃蛋白酶溶液的弓形蟲陽性動物心肌勻漿液置于37°C的恒溫水浴搖床中l(wèi)h ；
(4)過濾離心:將消化好的弓形蟲陽性動物心肌勻漿液用一次性紗布過濾并分裝，用常溫低速離心機(jī)離心；
(5)調(diào)PH:向(4)離心沉淀物中緩慢加入1.2%的碳酸氫鈉酚紅溶液并震蕩，直至溶液顏色由紅色變?yōu)殚冱S色，此時PH接近中性；
(6)加雙抗:將(5)得到的橘黃色液體再次離心除去上清液，向沉淀中加入與沉淀等體積的青鏈霉素混合液，室溫靜置后即得弓形蟲陽性動物心肌消化液；青鏈霉素混合液中，青霉素 200U/ml，鏈霉素 200ug/ml ；
C、昆明小鼠皮下接種弓形蟲陽性動物心肌消化液
選取健康的昆明小鼠若干，并對每只小鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，每一只小鼠背部皮下接種1ml的得弓形蟲陽性動物心肌消化液；
D、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測
接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，采取常規(guī)剖檢，摘取肺臟做組織研磨涂片鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有香蕉狀的弓形蟲速殖子即判別為弓形蟲陽性小鼠；五周內(nèi)未死亡的小鼠采血獲取血清，做弓形蟲抗體檢測，檢測結(jié)果陽性的即判定為弓形蟲陽性，同時五周內(nèi)未死亡的小鼠做大腦壓片，檢測是否含有弓形蟲包囊；
E、弓形蟲陽性昆明小鼠分離蟲株的獲得
接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，經(jīng)肺部研磨涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)香蕉狀弓形蟲速殖子的，將小鼠肺部研磨接種于細(xì)胞培養(yǎng)，采用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02，連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個弓形蟲速殖子；五周后的小鼠經(jīng)弓形蟲抗體檢測結(jié)果為陽性的，將其大腦或心臟研磨，將研磨液接種于細(xì)胞培養(yǎng)，用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02,連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個弓形蟲速殖子。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)選方案還可以是:
A、弓形蟲陽性動物樣品的獲得
針對弓形蟲病流行區(qū)域的動物進(jìn)行采血量為:大動物2-3ml/個體，小動物1ml/個體，將采集的血液離心時，轉(zhuǎn)速為:5000rpm/min，時間為5min，溫度為25°C，獲得動物血清lOOul，采用弓形蟲檢測試劑對血清弓形蟲抗體進(jìn)行檢測后，摘取該陽性動物的心臟；即獲得的弓形蟲陽性動物心臟樣品；
B、弓形蟲陽性動物心肌消化液的獲得:
(1)心臟處理:剔除心臟的被膜、筋膜、結(jié)締組織、脂肪等非心肌成份，并剪取50g心肌，用剪刀將弓形蟲陽性動物心肌剪碎；
(2)弓形蟲陽性動物心肌勻漿:將剪碎后的弓形蟲陽性動物心臟置于勻漿機(jī)內(nèi)15sec后，再加生理鹽水勻漿；
(3)胃蛋白酶消化:向弓形蟲陽性動物心臟勻漿液內(nèi)加入250ml胃蛋白酶溶液，加入量按體積比為:弓形蟲陽性動物心肌:胃蛋白酶溶液=1:5;將加入胃蛋白酶溶液的弓形蟲陽性動物心肌勻漿液置于37°C的恒溫水浴搖床中l(wèi)h ;胃蛋白酶溶液配制:胃蛋白酶5.2g，NaCl 10.0g,6NHCl 28ml,清水 1000ml，PH=1 ;
(4)過濾離心:將消化好的弓形蟲陽性動物肌肉勻漿液用一次性紗布過濾并分裝，用常溫低速離心機(jī)離心，1200 g, lOmin, 25°C ；
(6)加雙抗:將(5)得到的橘黃色液體再次離心，1200g ,10min, 25°C，除去上清液，向沉淀中加入與沉淀等體積的青鏈霉素混合液，室溫靜置約20min即得弓形蟲陽性動物心肌消化液；青鏈霉素混合液中:青霉素200U/ml，鏈霉素200ug/ml ；
C、昆明小鼠皮下接種心得弓形蟲陽性動物肌肉消化液
選取健康的昆明小鼠若干10只，并對每只小鼠進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，每一只小鼠背部皮下接種1ml的得弓形蟲陽性動物心肌消化液，緩慢推針，緩慢退針；
D、接種后昆明小鼠的階段性護(hù)理
接種后的小鼠需要每日動態(tài)觀察體態(tài)特征，如果在一周內(nèi)出現(xiàn)被毛逆立，蜷縮惡動，食欲下降等不良癥狀，要及時皮下注射抗生素:青霉素200U/ml，鏈霉素200ug/ml)；
E、接種后昆明小鼠弓形蟲陽性檢測
接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，采取常規(guī)剖檢，摘取肺臟做組織研磨涂片鏡檢，若發(fā)現(xiàn)有香蕉狀的弓形蟲速殖子即可判別為弓形蟲陽性小鼠；五周內(nèi)未死亡的小鼠采血獲取血清，做弓形蟲抗體檢測，檢測結(jié)果陽性的即可判定為弓形蟲陽性，同時五周內(nèi)未死亡的小鼠做大腦壓片，檢測是否含有弓形蟲包囊；
F、弓形蟲陽性昆明小鼠分離蟲株的獲得
接種后，五周內(nèi)死亡的小鼠，經(jīng)肺部研磨涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)香蕉狀弓形蟲速殖子的，將小鼠肺部研磨接種于細(xì)胞培養(yǎng)，采用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02，連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個弓形蟲速殖子；五周后的小鼠經(jīng)弓形蟲抗體檢測結(jié)果為陽性的，可將其大腦或心臟研磨，將研磨液接種于細(xì)胞培養(yǎng)，用Vero細(xì)胞，37°C，5%C02，連續(xù)培養(yǎng)21天，即可獲得105個弓形蟲速殖子。
[0008]本發(fā)明積極效果是:
1、投入成本較低；
2、能夠有大范圍高效地篩選弓形蟲陽性動物樣品；
3、分離出新型弓形蟲蟲株的程序簡單，效果顯著，便于常規(guī)條件操作。
[0009]能夠更方便地為弓形蟲疫苗研究提供新型弓形蟲蟲株。
[0010]4、本發(fā)明采用胃蛋白酶消化的方法，可以接種50克或超過50克的組織；背部接種小鼠降低了小鼠的死亡率。
[0011]【具體實施方式】:
實施例一、
實施弓形蟲蟲株分離的原料、器械及試劑:
剛地弓形蟲陽性動物、昆明小鼠、鼠籠、飲水瓶、號碼吊牌、采血針、離心管、離心機(jī)、移液槍、弓形蟲抗體檢測試劑、消化器械:包括天平、剪刀、勻漿機(jī)、紗布、一次性過濾碗、胃蛋白酶、6Ν鹽酸、生理鹽水、1.2%碳酸氫鈉溶液、酚紅、青鏈霉素混合液；接種器械:包括一次性注射器、70%酒精、耳標(biāo)號、耳標(biāo)鉗； 弓形蟲蟲株的分離可以分為以下幾個步驟:
A、弓形蟲陽性動物樣品的獲得
針對弓形蟲病流行區(qū)域的動物進(jìn)行采血:大動物2-3ml/個體，小動物1ml/個體，EP管盛放采集的血液即可，將采集的血液離心(5000rpm/min,5min,25°C)獲得動物血清lOOul ；采用弓形蟲檢測試劑對血清弓形蟲抗體進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果為陽性的動物個體標(biāo)記為弓形蟲抗體陽性動物，并摘取該陽性動物的心臟、肌肉、大腦，隨機(jī)選取三個部位剪取心臟、肌肉、大腦，剪取總量以50g為宜，心臟、肌肉、大腦小于50g的動物個體摘取整個心臟、全部肌肉和大腦。此時即獲得的弓形蟲陽性動物樣品。
[0012]B、弓形蟲陽性動物心臟、肌肉消化液的獲得
(1)心臟處理:剔除心臟的被膜、筋膜、結(jié)締組織、脂肪等非心肌成份，并剪取50g心肌，用剪刀剪碎。
[0013](2)心肌勻漿:將剪碎后的心肌置于勻漿機(jī)內(nèi)，先不加生理鹽水勻漿15sec，加入125ml生理鹽水勻漿大約30sec，倒出勻漿液，再用125ml生理鹽水沖洗勻漿機(jī)，勻漿液和沖洗液合為一體為心肌勻漿液并用1000ml塑料廣口瓶盛放并貼上標(biāo)簽；心肌與生理鹽水量之比為50:250 ；
(3)胃蛋