弓形蟲核酸適配體序列及其用于制備弓形蟲病診斷試劑或者制品上的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用核酸適配體用于弓形蟲病早期急性感染檢測和診斷的方法，核酸適配體分別為YZ?39，YZ?56。該核酸適配體的作用機理是與弓形蟲的棒狀體分泌蛋白ROP特異性結合。由于分泌蛋白ROP蛋白是弓形蟲侵染宿主細胞的早期分泌蛋白，對于弓形蟲病的早期急性感染診斷有重要意義。目前國內外還沒有關于利用核酸適配體檢測分泌蛋白ROP對弓形蟲早期急性感染進行檢測的報道。ROP特異性的核酸適配體的發(fā)現和應用對于弓形蟲病的早期急性感染的檢測提供新方法。
【專利說明】
弓形蟲核酸適配體序列及其用于制備弓形蟲病診斷試劑或者制品上的用途
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學和臨床醫(yī)學的技術領域，涉及一類與弓形蟲相關的核酸適配體用于弓形蟲病的早期急性感染診斷和檢測的試劑或者制品上的用途。
【背景技術】
[0002]自從利用雜交瘤技術產生單克隆抗體發(fā)明以來，抗體對于整個醫(yī)學研究，臨床診斷和生物治療的發(fā)展做出了巨大貢獻。核酸適配體不但和抗體一樣能與靶分子高效、特異地結合，而且具有許多抗體無法比擬的優(yōu)點，如分子量小、自身穩(wěn)定性強、變性復性快速可逆、易修飾修與標記等?；诤怂徇m配體的識別與檢測方法，正逐漸成為一種新的、普遍適用的技術，為化學、分子生物學以及醫(yī)學等領域提供一種高效、快速的分析檢測方法。
[0003]核酸適配體是通過指數富集配體系統(tǒng)進化(systematic evolut1n of ligandsby exponential enrichment ,SELEX)技術從體外人工篩選得到的，能與相應配體專一性緊密結合的一類RNA或單鏈DNA (ssDNA)分子，一般由幾十個核苷酸(20 —100 nt)組成。核酸適配體與各種配體的結合是基于單鏈核酸結構和空間構象的多樣性，它可通過鏈內某些互補堿基間的配對以及靜電作用、氫鍵作用等自身發(fā)生適應性折疊，形成一些穩(wěn)定的三維空間結構，如發(fā)卡(hairpin)、假結(pseudoknot)、凸環(huán)(stem loop)、G2四分體(G2 quartet)等。
[0004]剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種專性細胞內寄生，機會致病原蟲，引起人和動物共患的弓形蟲病(toxoplasmosis)，尤其在宿主免疫功能低下時，可致嚴重后果。WHO數據顯示弓形蟲的感染呈世界性分布，全球成人感染率從10%到90%不等。弓形蟲感染通常是無癥狀的，但先天性感染和免疫功能低下者的獲得性感染常引起嚴重的弓形蟲病。
[0005]先天性弓形蟲病:感染弓形蟲的初孕婦女，可經胎盤血流將弓形蟲傳播給胎兒。在孕前3個月內感染，可造成流產、早產、畸胎或死胎。
[0006]獲得性弓形蟲病:弓形蟲常累及腦和眼部，引起中樞神經系統(tǒng)損害，如腦炎、癲癇和精神異常，弓形蟲眼病以視網膜脈絡膜炎為多見，成人表現為視力突然下降，嬰幼兒可見手抓眼癥，對外界事物反應遲鈍，也有出現斜視、虹膜睫狀體炎、色素膜炎等。
[0007]隱性感染者若患有惡性腫瘤、因長期接受免疫抑制劑和放射治療等引起的醫(yī)源性免疫受損或先天性、后天性免疫缺陷者，如艾滋病患者，都可使隱性感染轉變?yōu)榧毙曰騺喖毙?，從而出現嚴重的全身性弓形蟲病，其中多因并發(fā)弓形蟲腦炎而死亡。
[0008]弓形蟲病的實驗室診斷包括:病原學檢查，免疫學診斷，分子生物學檢測，影像學檢查。弓形蟲抗體檢測是目前最主要的輔助檢查方法，通常需聯(lián)合進行IgG和IgM抗體平行檢測，1.1gM抗體升高是急性感染出現較早的敏感標志，一般在感染后I周出現，維持3?6個月，個別感染者可持續(xù)I年以上。2.1gG抗體通常在感染后I?2周出現，I?2個月后達高峰，以后逐漸下降，并可終生持續(xù)陽性，因此IgG陽性不能區(qū)分急慢性感染由Reshika Dhakal等人進行的研究中，研究對象為2003年至2013年來自非參考實驗室，將IgM和IgG陽性的451名患者標本拿到帕洛阿爾托基礎醫(yī)學弓形蟲實驗室(PAMF-TSL)采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測，對這些病人進行回顧性的評估:是急性感染還是慢性感染。該研究將患者分成4組:慢性感染，急性感染，沒有感染，結果不確定。AMF-TSL結果顯示:在451名患者中，有335名(74%)屬于慢性感染，100名(22%)屬于急性感染，有7名(2%)沒有感染，而且有9名(2%)的結果不確定。由此可以看出，在非參考實驗室中獲得的弓形蟲IgM和IgG陽性結果不能準確的區(qū)分慢性感染和急性感染。鑒于多種因素的影響，一種慢性的弓形蟲感染會錯誤的歸為急性感染，從而導致一些不良的后果，特別針對妊娠女性，會造成極大的精神壓力和引起不必要的干預措施，包括終止妊娠。
[0009]因此開發(fā)一種弓形蟲早期急性感染的快速，特異的檢測方法對于傳統(tǒng)IgG和IgM抗體平行檢測具有很好的輔助作用，具有重要的臨床診斷意義。

【發(fā)明內容】

[0010]為了克服現有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供可用于識別弓形蟲的核酸適配體，以及利用該核酸適配體制備用于弓形蟲早期急性感染的診斷試劑或者制品的用途。核酸適配體YZ-39和YZ-56是基于SELEX方法篩選出來的核酸適配體。我的研究發(fā)現，YZ-39和YZ-56核酸適配體可以特異性識別弓形蟲棒狀體分泌蛋白以及弓形蟲感染的人體細胞和人體血清樣本。利用核酸適配體對于弓形蟲的分泌蛋白檢測尚未有任何報道，其將為弓形蟲的早期診斷提供新的策略。
[0011]核酸適配體YZ-39和YZ-56，序列為
YZ-39:TCCTGGCAGCGCTTTTGCTTGTTTGCTCTCGTACCTGTCCYZ-56:CGCACCGATCCGGTGTTAATCTCGACGTCCCTTAAGTTTG
所述的核酸適配體YZ-39和YZ-56的用途，用于弓形蟲早期急性感染的檢測的診斷試劑或者制品。
[0012]本發(fā)明的YZ-39和YZ-56是一類能特異性靶向結合弓形蟲早期感染的棒狀體分泌蛋白的核酸適配體，可以在實驗室條件下和臨床條件下特異性檢測含有弓形蟲棒狀體分泌蛋白的溶劑，弓形蟲蟲體，血清樣本等。具有核酸適配體的通用特點，如:高親和力，高特異性，穩(wěn)定性高，無毒性，免疫原性低。核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別弓形蟲棒狀體分泌蛋白R0P，而不識別對照標簽蛋白GST;熒光標記的核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別感染到人體細胞內的弓形蟲;其中YZ-39和YZ-56核酸適配體可以特異性識別含有弓形蟲抗原的人體血清樣本；同時YZ-39和YZ-56可以特異性識別患有急性弓形蟲病的病人血清樣本。綜上，YZ-39和YZ-56對弓形蟲感染的早期分泌蛋白ROP的特異性的識別，將有助于開發(fā)針對弓形蟲早期急性感染快速檢測試劑。
[0013]本發(fā)明的主要優(yōu)點和有益效果:
核酸適配體不但和抗體一樣能與靶分子高效、特異地結合，而且具有許多抗體無法比擬的優(yōu)點，如分子量小、靶分子廣泛(包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫原性的物質)、自身穩(wěn)定性強、變性復性快速可逆、免疫原性低、體外篩選不依賴動物或細胞和易進行多種修飾修與標記等。核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性結合弓形蟲致病性的棒狀體蛋白R0P。核酸適配體YZ-39和YZ-56同時能特異性識別感染到人體細胞內的弓形蟲。在臨床研究上，該核酸適配體可以有效的識別含有弓形蟲抗原的血清樣本和急性弓形蟲病的病人的血清樣本。上述結果顯示YZ-39和YZ-56是一種新型檢測弓形蟲的后續(xù)制劑。本發(fā)明對于弓形蟲的特異性診斷，尤其是早期急性感染的快速診斷具有重大意義。
[0014]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0015]圖1為采用核酸適配體YZ-39，YZ-56和弓形蟲棒狀體分泌蛋白ROP特異性結合。
[0016]圖2為采用不同濃度核酸適配體ΥΖ-39和弓形蟲棒狀體分泌蛋白ROP特異性結合圖3為采用核酸適配體ΥΖ-39和ΥΖ-56與侵染到人體細胞內弓形蟲特異性結合
圖4為采用核酸適配體ΥΖ-39和ΥΖ-56與含有弓形蟲抗原的血清樣本特異性結合圖5為采用核酸適配體ΥΖ-39和ΥΖ-56和弓形蟲早期急性感染的病人血清樣本特異性全士么彡口 I=I
【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖對本發(fā)明做詳細具體的介紹，旨在進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0018]核酸適配體ΥΖ-39和ΥΖ-56是采用一種基于SELEX的方法，采用弓形蟲棒狀體分泌蛋白ROP-GST為篩選對象，GST標簽蛋白為反向篩選對象，經過15輪的篩選出來，能特異性與弓形蟲棒狀體分泌蛋白ROP特異性結合的核酸適配體。ΥΖ-39和ΥΖ-56是通過DNA合成儀按照它們的序列順序合成，然后通過高效液相色譜(HPLC)或者是變性電泳(ULTRAPAGE)純化，最后通過離心濃縮干燥而制備。
[0019]優(yōu)選的，為了明確篩選的核酸適配體YZ-39和YZ-56對弓形蟲棒狀體分泌蛋白特異性結合，我選取了 GST標簽蛋白和棒狀體分泌蛋白ROP-GST進行結合實驗，通過三次獨立重復實驗后，結果如圖1所示，相比于標簽蛋白GST的對照，發(fā)現YZ-39和YZ-56都能特異性的結合弓形蟲分泌蛋白ROP。進一步采用ROP-GST棒狀體分泌蛋白和FI TC熒光標記的不同濃度的核酸適配體YZ-39 反應(OnM，6.25nM，12.5nM，25nM，50nM，10nM，200nM，400nM)，經過三次獨立重復試驗后，結果如圖2所示，YZ-39能呈現劑量依賴性結合弓形蟲棒狀體分泌蛋白ROPCKd 值約為 I OOnM)。
[0020]優(yōu)選的，為了觀察YZ-39和YZ-56與感染到人體細胞內的弓形蟲結合情況，將10nM FITC熒光標記的核酸適配體YZ-39和YZ-56分別與弓形蟲感染的人包皮成纖維(Human foreskin fibroblast，HFF)細胞和正常未感染的HFF細胞在室溫條件下孵育，制片后在熒光顯微鏡下觀察。結果如圖3所示，可見核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別感染到HFF細胞內的弓形蟲。
[0021]優(yōu)選的，為了研究核酸適配體是否能應用于臨床，對弓形蟲患者的血清的檢測，300nM B1tin標記的核酸適配體YZ-39和YZ-56與含有不同濃度的弓形蟲抗原的人血清樣本(12.5yg/ml, 25yg/ml, 100yg/ml，200yg/ml)相互作用，結果如圖4所不，相比于BSA對照，YZ-39和YZ-56能呈現劑量依賴性結合含有弓形蟲抗原的人血清。300nM B1tin標記的核酸適配體YZ-39和YZ-56與弓形蟲早期急性感染的病人血清樣本相互作用，結果如圖5所示，核酸適配體YZ-39和YZ-56可以特異性識別弓形蟲病新近急性感染的病人的血清樣本。
[0022]結論: 1)核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別弓形蟲棒狀體分泌蛋白ROP，而不結合對照標簽蛋白GST;
2)核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別感染到人體細胞內的弓形蟲；
3)核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別含有弓形蟲抗原的人血清。
[0023]核酸適配體YZ-39和YZ-56能特異性識別弓形蟲早期急性感染的病人的血清樣本。
【主權項】
1.一類核酸適配體YZ-39，YZ-56其特征在于，序列為 ΥΖ-39:TCCTGGCAGCGCTTTTGCTTGTTTGCTCTCGTACCTGTCC ΥΖ-56: CGCACCGATCCGGTGTTMTCTCGACGTCCCTTAAGTTTG。2.根據權利要求1所述的核酸適配體ΥΖ-39，ΥΖ-56的用途，其特征在于，用于制備弓形蟲病早期急性感染的診斷的試劑或者制品。
【文檔編號】C12N15/115GK105861511SQ201610210954
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】張陽
【申請人】張陽