一種顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診治靶點(diǎn)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤標(biāo)志物，具體涉及一種顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診治靶點(diǎn)及其應(yīng)用，更具體的 涉及HAPLN1基因及其表達(dá)產(chǎn)物在診治顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]盧頁(yè)內(nèi)動(dòng)脈瘤（intracranialaneurysm，IA)的形成病因和發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，對(duì)IA 的病因和形成機(jī)制的研究一直是國(guó)內(nèi)外腦血管疾病研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)領(lǐng)域。通常認(rèn)為IA的 形成、發(fā)展和破裂是由遺傳、吸煙、年齡、環(huán)境、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和高血脂以及血流動(dòng) 力學(xué)改變等多重因素造成的。隨著對(duì)其研究的不斷深入，人們己經(jīng)逐漸認(rèn)識(shí)到血流動(dòng)力學(xué) 因素在IA的發(fā)生、發(fā)展和破裂過(guò)程中起著非常重要的作用。IA通常多發(fā)生在willis動(dòng)脈環(huán) 以及顱內(nèi)動(dòng)脈血管分叉處或血管彎曲部位，血液流經(jīng)此處時(shí)形成沖擊流等復(fù)雜流型使血管 內(nèi)皮細(xì)胞及其連接受損，炎癥細(xì)胞和炎性物質(zhì)等更易進(jìn)入內(nèi)皮下，引起的血管壁炎癥和血 管壁重構(gòu)失調(diào)，研究顯示持續(xù)的血流動(dòng)力學(xué)變化會(huì)導(dǎo)致血管的病理重構(gòu)，包括內(nèi)彈力層的 降解、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的缺失、細(xì)胞增殖減少等。血流動(dòng)力學(xué)因素改變所導(dǎo)致的血管 內(nèi)皮損傷以及接下來(lái)出現(xiàn)的血管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白酶降解所致的血管壁病理性重構(gòu)被 認(rèn)為是IA形成過(guò)程中的主要病理生理環(huán)節(jié)。無(wú)論是通過(guò)觀察人的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁分子病理學(xué) 的研究還是從對(duì)IA形成過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)研究均證明了血管內(nèi)皮損傷是IA形成過(guò)程中的基本 環(huán)節(jié)。但具體哪些基因參與其中仍有待研究。
[0003]發(fā)明人對(duì)5例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤病例組和3例對(duì)照組組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物 信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，在差異表達(dá)明顯的基因中挑選出高表達(dá)的候選基因HAPLN1，已 有研究表明HAPLN1和假性軟骨發(fā)育不全有關(guān)，但并沒(méi)有研究揭示其與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的關(guān)系， 發(fā)明人進(jìn)行了分子驗(yàn)證，證實(shí)了HAPLN1在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組中高表達(dá)。本發(fā)明提供了新的顱內(nèi) 動(dòng)脈瘤的監(jiān)測(cè)治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑，所述顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑檢測(cè) HAPLN1基因和/或HAPLN1基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0005]進(jìn)一步，所述顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方法 檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中HAPLN1基因的表達(dá)，優(yōu)選的，所述的熒光定量PCR試劑盒中含有一對(duì) 特異性擴(kuò)增HAPLN1基因的引物;所述的基因芯片中包括與HAPLN1基因的核酸序列雜交的探 針，更優(yōu)選的，焚光定量PCR試劑盒內(nèi)含有特異性檢測(cè)HAPLN1基因的上游引物和下游引物， 上游引物序列為SEQIDN0.9,下游引物序列為SEQIDN0.10。
[0006] 進(jìn)一步，直接檢測(cè)外周血和/或組織中HAPLN1基因和/或基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0007]進(jìn)一步，所述的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷制劑采用免疫方法檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤外周血和/ 或組織中HAPLN1基因的表達(dá)產(chǎn)物，優(yōu)選的，所述免疫方法為ELISA檢測(cè)和/或膠體金檢測(cè)。
[0008] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)HAPLN1表達(dá)產(chǎn)物的ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒。所述試劑 盒中的抗體可采用市售的HAPLN1單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的試劑盒包括:包被HAPLN1單克 隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng) 終止液等。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)HAPLN1蛋白的膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用 市售的HAPLN1單克隆抗體。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)或 膠體金滲濾法。進(jìn)一步，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)（T)噴點(diǎn)有抗 HAPLN1單克隆抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供上述顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷制劑在制備顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷工具中 的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑，所述制劑中含有抑制HAPLN1 基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的試劑或化合物。優(yōu)選的，制劑中含有藥劑學(xué)可接受的載體。
[0012]進(jìn)一步，所述治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑中含有激活HAPLN1的抑制基因、激活抑制HAPLN1表達(dá)的蛋白、導(dǎo)入抑制HAPLN1轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的siRNA、激活促進(jìn)HAPLNlmRNA降解的 microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)HAPLN1蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)HAPLN1表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0013] 優(yōu)選的，所述治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑含有下列中的一組或幾組siRNA:SEQID N0·1和SEQIDN0·2、SEQIDN0·3和SEQIDN0·4、SEQIDN0·5和SEQIDN0·6。更優(yōu)選的， 所述治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑含有siRNA序列為SEQIDN0.1和SEQIDN0.2。
[0014]本發(fā)明的目的在于提供上述治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑在制備顱內(nèi)動(dòng)脈瘤治療藥物 或試劑中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的目的在于提供上述治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的制劑在制備增強(qiáng)EPCs活性制劑中 的應(yīng)用。
[0016]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)方法篩選到候選基 因HAPLN1基因，進(jìn)而通過(guò)分子細(xì)胞生物學(xué)方法驗(yàn)證了HAPLN1基因與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的關(guān)系： HAPLN1基因在外周血中高表達(dá)，與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤具有很好的相關(guān)性，可用于制備顱內(nèi)動(dòng)脈瘤 輔助診斷制劑，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0017]本領(lǐng)域人員熟知抑制基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)通?？梢圆捎孟率龇椒ㄖ械囊环N 和/或幾種:通過(guò)激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表達(dá)的蛋白、采用RNA 干擾技術(shù)抑制目的基因表達(dá)、激活促進(jìn)目的基因mRNA降解的microRNA、導(dǎo)入促進(jìn)目的基因 編碼蛋白降解的分子、抑制促進(jìn)目的基因表達(dá)的因子及蛋白的表達(dá)。
[0018] RNA干擾(RNAi)是指外源性和內(nèi)源性雙鏈RNA在生物體內(nèi)誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA 特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，是一種使用小的雙鏈RNA高效、特異地阻斷體內(nèi) 某種特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失表型的技術(shù)。siRNA設(shè)計(jì) 完成后可以采用直接合成法或者構(gòu)建siRNA表達(dá)載體，制備好的siRNA可以通過(guò)磷酸鈣共沉 淀法、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、顯微注射或基因槍等機(jī)械法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體 試劑法等途徑轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0019] 熒光定量PCR法是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記 跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的 初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量。 多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù) 性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。
[0020] 基因芯片又稱(chēng)為DNA微陣列(DNAmicroarray)，可分為三種主要類(lèi)型：1)固定在聚 合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶 基因與其雜交，通過(guò)放射顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2)用點(diǎn)樣法固定在玻璃板上的DNA探針陣列， 通過(guò)與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)。3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核苷酸探針 陣列，與熒光標(biāo)記的靶基因雜交進(jìn)行檢測(cè)?；蛐酒鳛橐环N先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測(cè) 技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，其優(yōu)點(diǎn)有以下幾個(gè)方面:一是高度的靈敏性和準(zhǔn)確性;二是快速 簡(jiǎn)便;三是可同時(shí)檢測(cè)多種疾病。
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的基因檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒檢測(cè) 基因HAPLN1，采用特異的上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQIDN0.9,下游引物序 列為SEQIDN0.10。
[0022] 進(jìn)一步，該P(yáng)CR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈 敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0023] 進(jìn)一步，上述熒光定量PCR試劑盒組分包括:特異性引物、內(nèi)參引物、焚光定量PCR 反應(yīng)液。所述內(nèi)參為GAPDH。
[0024]所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0025] 本發(fā)明目的是提供了一種顱內(nèi)動(dòng)脈瘤蛋白檢測(cè)試劑盒，所述的檢測(cè)試劑盒檢測(cè) HAPLN1蛋白。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括其他檢測(cè)試劑。
[0026] 本發(fā)明目的是提供了一種檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的基因芯片，所述的基因芯片包括與 HAPLN1基因的核酸序列雜交的探針。
[0027]本發(fā)明的藥劑學(xué)上可接受的載體為在制劑時(shí)通常利用的載體，該載體包含乳糖 (lactose)、右旋糖(dextrose)、鹿糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀 粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽(alginate)、凝膠(gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯 P比略燒酮(polyvinylpyrrolidone)、纖維素（cellulose)、水、糖衆(zhòng)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥基苯甲酸甲酯(methy1hydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearicacidmagnesium)及礦物油（mineraloil) 等，但并非局限于此。
[0028] 本發(fā)明的藥劑學(xué)可接受的載體除了上述成分以外還可以包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜 味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學(xué)上許可的適合的載體和制劑詳細(xì)記載于 雷明登氏藥學(xué)全書(shū)。
[0029]本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能通過(guò)口服或非口服進(jìn)行給藥，作為非口服給藥時(shí)，能通 過(guò)靜脈內(nèi)注射，鼻腔內(nèi)注射，局部注射，腦室內(nèi)注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經(jīng)皮 給藥等方式進(jìn)行給藥。
[0030] 本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適合的給藥劑量根據(jù)制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態(tài)、食物