一種從皺瘤海鞘中分離黑麥草內(nèi)酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分離工藝領(lǐng)域，具體地說，涉及一種從皺瘤海鞘中分離黑麥草內(nèi) 酯的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 海鞘是尾索動物亞門海鞘綱的尾索動物，在自然界中已知有1500余種，主要分布 在熱帶及亞熱帶海域。我國海鞘資源豐富，已記錄的中國沿海海鞘種類有100余種，且有很 多為我國所特有。據(jù)報道，海鞘中含有多種具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎等活性的化合 物，因此，近年來，海鞘的化學(xué)成分及其生物活性成為了海洋天然產(chǎn)物研究的熱門領(lǐng)域。
[0003] 皺瘤海鞘（Styelaplicata)是海鞘中的一種，主要分布于我國中南沿海，福建、廣 東和海南等，部分地區(qū)也有人工養(yǎng)殖。皺瘤海鞘經(jīng)常在一些海產(chǎn)養(yǎng)殖過程中一同生長起來， 雖然皺瘤海鞘在部分地區(qū)有作為食物食用的習(xí)慣，但大部分的皺瘤海鞘仍然是作為養(yǎng)殖過 程中的副產(chǎn)物被丟棄掉，造成了大量的浪費。因此，如果能將皺瘤海鞘進行有效的利用，不 僅具有一定的經(jīng)濟價值，也可以解決浪費問題。
[0004] 黑麥草內(nèi)酯（Loliolide)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所不，其分子式為CnH1603，相對分子 量為196. 246。經(jīng)報道，黑麥草內(nèi)酯具有抗菌、抗腫瘤的生物活性，還可以抑制EB病毒的早 期抗原EBV-EA的產(chǎn)生；另有報道其具有一定的免疫抑制作用；此外，黑麥草內(nèi)酯還可以抑 制藻類生長，是一種潛在的水體富營養(yǎng)化控制劑。因此，黑麥草內(nèi)酯具有一定的研究價值與 經(jīng)濟價值。目前，黑麥草內(nèi)酯的主要來源是從植物中提取分離，而從皺瘤海鞘中提取分離黑 麥草內(nèi)酯的方法還未見報道。
[0005]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供了一種從皺瘤海鞘中分離黑麥 草內(nèi)酯的方法，方法簡單，提取時間短，效率高，得到的黑麥草內(nèi)酯純度高。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] -種從皺瘤海鞘中分離黑麥草內(nèi)酯的方法，包括：
[0009] 1)取皺瘤海鞘，用乙醇浸提得到乙醇粗提物；乙醇粗提物用甲醇溶解后過濾，濾 液濃縮得到粗提物溶液，按粗提物溶液與正相硅膠體積比為1:4~8的比例，用100~200 目的正相硅膠進行柱層析；以二氯甲烷-甲醇混合液作為洗脫液，且依次按100%二氯甲烷 -0. 5~1. 5%甲醇一8~12%甲醇一45~55%甲醇一100%甲醇進行梯度洗脫，每一梯 度洗脫1~7個柱體積，分別收集每個柱體積的洗脫液，濃縮至干，進行TLC分離；所述TLC 分離條件為：硅膠G254薄層板，體積比8~12:1的二氯甲烷-甲醇混合液作為展開劑；
[0010] 2)取步驟1)TLC中Rf值為0. 45~0. 55的組分，合并后進行反相固相萃取分離， 采用BondElutC18固相萃取柱，真空固相萃取裝置，濕法上樣，以甲醇-水混合液作為洗 脫液，且依次按100%水一25~35%甲醇一65~75%甲醇一100%甲醇進行梯度洗脫，每 一梯度洗脫1~7個柱體積，收集各梯度的洗脫液，得到100%水組分、25~35%甲醇組分、 65~75%甲醇組分、100%甲醇組分；
[0011] 3)取步驟2)中得到的25~35%甲醇組分，濃縮至干，得到粗品；
[0012] 4)取步驟3)中得到的粗品，用甲醇配置成0. 8~1. 2mg/mL，采用HPLC進行純化； HPLC條件為：固定相：HPLC半制備柱0DS-A，20X250mm，柱內(nèi)徑5μπι;流動相：45~55%甲 醇；流速：6~10mL/min;進樣量：0· 95~1. 05mL;檢測器：檢測波長：210nm和220nm;收集 22~28min大峰出現(xiàn)時的洗脫液，濃縮，即得黑麥草內(nèi)酯。
[0013] -實施例中：所述步驟1)中，粗提物溶液與正相硅膠體積比為1:5. 5~6. 5 ;以二 氯甲烷-甲醇混合液作為洗脫液，且依次按100%二氯甲烷一〇. 8~1. 2%甲醇一9. 5~ 10. 5%甲醇一49~51 %甲醇一100%甲醇進行梯度洗脫，每一梯度洗脫2~6個柱體積， 分別收集每個柱體積的洗脫液，濃縮至干，進行TLC分離；所述TLC分離條件為中，展開劑為 體積比9~11:1的二氯甲烷-甲醇混合液。
[0014]一實施例中：所述步驟2)中，取步驟1)TLC中Rf值為0.48~0.52的組分；反相固 相萃取分離中，以甲醇-水混合液作為洗脫液，且依次按100%水一29~31%甲醇一69~ 71 %甲醇一100%甲醇進行梯度洗脫，每一梯度洗脫2~6個柱體積，收集各梯度的洗脫液， 得到100%水組分、29~31 %甲醇組分、69~71 %甲醇組分、100%甲醇組分。
[0015]-實施例中：所述步驟3)中，取步驟2)中得到的29~31%甲醇組分，濃縮至干， 得到粗品。
[0016] -實施例中：所述步驟4)中，取步驟3)中得到的粗品，用甲醇配置成0.9~ 1.lmg/mL;HPLC條件中：流動相：49~51 %甲醇；流速：7~9mL/min;溶液傳輸單元： LC-6AD;進樣器：SIL-10AP;進樣量：0.95~1.05mL;檢測器：光電二極管陣列檢測器 STO-M20A;收集24~26min大峰出現(xiàn)時的洗脫液，濃縮，即得所述之黑麥草內(nèi)酯。
[0017] -實施例中：所述步驟1)中，用乙醇浸提得到乙醇粗提物的方法為：取皺瘤海鞘， 陰干，切碎，向切碎后皺瘤海鞘中加入1~1. 5倍體積的乙醇，置均質(zhì)機中破碎后，浸提6~ 8d，浸提液取出備用；重新加入1~1. 5倍體積的乙醇，浸提2~4d后，浸提液取出備用；再 次加入1~1. 5倍體積的乙醇，浸提2~4d后，取出備用；三次得到的的浸提液相互合并， 回收溶劑，即得乙醇粗提物。
[0018]-實施例中：所述浸提過程中，每天超聲振動提取0.5~2h。
[0019]一實施例中：其特征在于：所述步驟1)中，正相硅膠型號為SY01。
[0020] -實施例中：所述步驟2)中，真空固相萃取裝置為12管或24管真空固相萃取裝 置。
[0021] -實施例中：所述步驟2)中，所述固相萃取柱為若干根固相萃取柱并聯(lián)。
[0022] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點：
[0023] 1.黑麥草內(nèi)酯的傳統(tǒng)來源之一是從植物中提取，但植物提取方法比較繁瑣，其中 具有葉綠素等色素，還有纖維素等，這些物質(zhì)干擾性較強且不易除去，且植物細(xì)胞具有細(xì)胞 壁，相對提取效率較低；本發(fā)明提供了一種從皺瘤海鞘中分離黑麥草內(nèi)酯的方法，皺瘤海鞘 作為一種海洋動物，不具有細(xì)胞壁，而且其中的成分較為單純，含有的氨基酸、糖類的物質(zhì) 也相對容易去除，因此，從皺瘤海鞘中提取黑麥草內(nèi)酯，比從植物中提取，方法更為簡單，且 提取效率更高，純度更高。
[0024] 2.皺瘤海鞘經(jīng)常在其他海產(chǎn)養(yǎng)殖中一并成長起來，以往都是作為副產(chǎn)物被丟棄 掉，造成了大量的浪費，本發(fā)明提供了從皺瘤海鞘中提取黑麥草內(nèi)酯的方法，為皺瘤海鞘的 再利用提供了思路，可以有效減少了浪費，實現(xiàn)節(jié)約資源的目的。
[0025] 3.本發(fā)明的從皺瘤海鞘中提取黑麥草內(nèi)酯的方法，采用了反相固相萃取的方式， 與傳統(tǒng)的分子篩相比，所需時間大大縮短，能夠縮短提取時間一倍以上，提取效率更高，而 且成本可比分子篩降低至少一倍；與反相液相色譜提取方法相比，能夠大大減少提取過程 中樣品損耗較大的問題。
【附圖說明】
[0026] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0027] 圖1為本實施例1中得到的黑麥草內(nèi)酯在流動相為50%甲醇時的HPLC分析譜圖。
[0028] 圖2為本實施例1中得到的黑麥草內(nèi)酯的MS譜圖。
[0029] 圖3為本實施例1中得到的黑麥草內(nèi)酯的1Η譜譜圖。
[0030] 圖4為本實施例1中得到的黑麥草內(nèi)酯的13C譜譜圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過實施例具體說明本發(fā)明的內(nèi)容：
[0032] 實施例1
[0033] 1)取濕重10kg的皺瘤海鞘，陰干，切碎，向切碎后皺瘤海鞘中加入1. 25倍體積的 乙醇，置均質(zhì)機中破碎后，置于5L燒杯中，浸提7d且浸提過程中每天超聲振動提取lh以加 速提取，浸提液取出備用；重新加入1. 25倍體積的乙醇，浸提3d且浸提過程中每天超聲振 動提取lh以加速提取，浸提液取出備用；再次加入1. 25倍體積的乙醇，浸提3d且浸提過程 中每天超聲振動提取lh以加速提取，浸提液取出備用；三次得到的的浸提液相互合并，以 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)回收溶劑，即得乙醇粗提物120g;向乙醇粗提物中加入甲醇直至溶劑呈無 色，過濾，除去不溶性雜質(zhì)如鹽類等，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)回收溶劑并濃縮至50ml，得到 粗提物溶液；按粗提物溶液與正相硅膠體積比為1:6的比例量取正相硅膠進行柱層析；本 實施例之中，所述正相硅膠為SY01，100~200目，用量為600g;以二氯甲烷-甲醇混合液 作為洗脫液，依次按100%二氯甲燒一1 %甲醇一10%甲醇一50%甲醇一100%甲醇進行梯 度洗脫，每一梯度洗脫3~5個柱體積，分別收集每個柱體積的洗脫液，濃縮至干，進行T