一種高通量裂解大腸桿菌細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及大腸桿菌細(xì)胞作為外源基因重組表達(dá)的宿主細(xì)胞 及其裂解方法;其本質(zhì)為當(dāng)外源蛋白在大量單克隆中同步誘導(dǎo)表達(dá)后，快速同步裂解來自 不同克隆的大腸桿菌細(xì)胞以測定所誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白活性所需的細(xì)胞裂解液樣品制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌細(xì)胞是外源基因重組表達(dá)最常用的宿主細(xì)胞。在篩選重組表達(dá)蛋白的突 變體或者表征這些突變體的序列和性質(zhì)關(guān)系時(shí)，用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) 后，需快速裂解大量克隆的大腸桿菌細(xì)胞以測定細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的活性。對于篩 選酶或抗體類蛋白的突變體庫時(shí)，更需要高通量的方法快速裂解大量的大腸桿菌細(xì)胞克 隆。用微孔板進(jìn)行裂解是實(shí)現(xiàn)高通量同步操作的基本策略?？紤]微孔板中裂解的特殊性，用 凍融的方法裂解細(xì)胞需多次反復(fù)凍融才有足夠的裂解效力故操作效率很低，尤其裂解效力 低且對某些不耐受反復(fù)凍融的外源蛋白不適用。用多探頭超聲同步裂解微孔中的多個(gè)細(xì)胞 克隆裂解效力強(qiáng)且效率很高，但需要特殊的昂貴設(shè)備，且每個(gè)探頭的能量效率差異會(huì)造成 裂解效力的顯著差異而干擾比較誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的活性。用化學(xué)方法裂解細(xì)胞重現(xiàn)性 好，無需特殊設(shè)備，易于實(shí)現(xiàn)高通量裂解，但需要特殊的裂解液。目前所用化學(xué)裂解方法常 用溶菌酶在中性條件下溫和裂解，但溶菌酶的用量對裂解效力影響很大，用大量的溶菌酶 裂解效力尚但成本很尚。
[0003] 大腸桿菌細(xì)胞不耐受堿性緩沖液;用強(qiáng)堿加強(qiáng)的表面活性劑裂解大腸桿菌細(xì)胞是 制備質(zhì)粒的最常規(guī)方法;但其所用裂解條件會(huì)造成幾乎所有的蛋白變性失活。只有篩選到 能保障對所誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白活性和穩(wěn)定性影響低于10%的堿性緩沖液，才能用于通量裂 解大腸桿菌細(xì)胞;尤其能篩選到需測定活性外源蛋白能耐受的表面活性劑，則可進(jìn)一步加 速裂解。
[0004] 大腸桿菌的堿性磷酸酶、各種來源的尿酸酶、綠膿桿菌芳香硫酸酯酶，都能耐受pH 9.0的高濃度緩沖液，且對0.1 %的Tween-20也能耐受。篩選這些酶蛋白的突變體庫時(shí)，就可 用本發(fā)明所述的裂解方法高通量制備大腸桿菌的細(xì)胞裂解液，以高通量篩選其突變體庫。 對于其它能耐受高濃度堿性裂解緩沖液的酶或蛋白，此高通量裂解方法也適用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 1. -種高通量裂解大腸桿菌細(xì)胞的方法，適用于同步裂解不同克隆的大腸桿菌細(xì) 胞測定誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白活性，其裂解過程特征在于：
[0006] (一)篩選緩沖介質(zhì)：最適緩沖區(qū)間在pH 8.5到10.5之間、室溫溶解度不低于0.8M， 包括但不限于三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、硼酸鹽；
[0007] (二)針對在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)后需測定活性的外源蛋白，按下述篩選表面活性 劑：
[0008] (1)終濃度不高于0.01%時(shí)，對測定大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的活性無干擾；
[0009] (2)終濃度不高于0.1 %時(shí)，與需測定活性外源蛋白作用3小時(shí)對活性影響小于 10% ；
[0010] (3)候選表面活性劑包括但不限于tween-20、NP_40、Triton X-100;
[0011] (4)如篩選不到滿足要求的表面活性劑，則以下操作過程中不用表面活性劑；
[0012] (三)制備滿足如下要求的候選裂解緩沖液：
[0013] ⑴所選緩沖介質(zhì)的濃度不低于〇. 8M，其pH在8.5到12.0間；
[0014] (2)滿足要求表面活性劑的體積濃度或質(zhì)量濃度不低于0.01 %但不高于0.3% ;
[0015](四）按下述標(biāo)準(zhǔn)篩選合適的裂解緩沖液：
[0016] (1)需測定活性外源蛋白在所述緩沖液中處理3小時(shí)，其活性變化不超過10%;
[0017] (2)緩沖液稀釋10倍以后，對測定大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白的活性影響低于 10% ；
[0018] (3)同時(shí)滿足上述兩項(xiàng)要求的緩沖液，以下簡稱為裂解緩沖液；
[0019] (五)按如下所述，將裂解緩沖液與大腸桿菌細(xì)胞懸液混合并轉(zhuǎn)移到微孔板中：
[0020] (1)所用微孔板上，每個(gè)微孔的最大容量不小于0.06ml;
[0021] (2)取不少于10μ1大腸桿菌細(xì)胞懸液與不少于5倍體積的裂解緩沖液在微孔板中 直接混合得待裂解混合物;或在試管中先將不少于1〇μ1的大腸桿菌細(xì)胞懸液與不少于5倍 體積的裂解緩沖液混合得待裂解混合物，再將不少于〇. 〇40ml待裂解混合物轉(zhuǎn)移到微孔板 中；
[0022] (3)每個(gè)微孔中待裂解混合物不超過微孔最大容量的90%但不少于微孔最大容量 的 20 %;
[0023] (六)將微孔板及其待裂解混合物室溫持續(xù)快速震蕩;持續(xù)震蕩時(shí)間不短于2小時(shí)， 但不長于需測定活性外源蛋白在裂解緩沖液中活性變化小于10%的最長時(shí)間，得到裂解液 樣品。
[0024] 2.據(jù)權(quán)利要求1所述一種高通量裂解大腸桿菌細(xì)胞方法，其所用裂解緩沖液適合 但不要求含有非選擇性蛋白酶抑制劑;此類蛋白酶抑制劑包括但不限于對氨基苯甲脒和對 甲苯磺酰氟;如含有此類蛋白酶抑制劑，其濃度限制在對外源蛋白的活性和穩(wěn)定性都無影 響水平。
[0025]應(yīng)用實(shí)施例 [0026]所用材料、試劑和設(shè)備
[0027] 綠膿桿菌芳香硫酸酯酶(PAAS)載體、表達(dá)、純化、活性測定和活性單位定義等見文 獻(xiàn)[Liu H，et al .Analytical Sciences，2015;31(5) :421-427]。測定活性所用緩沖液為 1.0M Tris-HCl pH 9.0;底物4-硝基苯基硫酸酯（4NPS)終濃度2.0mM;用405nm吸收監(jiān)測 PAAS反應(yīng)，計(jì)算從啟動(dòng)反應(yīng)8. Omin到15min之間的吸收變化速度為初速度，以便用酶標(biāo)儀測 定;每分鐘釋放1.0微摩爾的對硝基酚的PAAS活性為一個(gè)單位(U)。用北京北川飛虹生物科 技有限公司的M+-NTA-瓊脂糖柱純化后，比活性大于32單位每毫克，變性電泳檢測未發(fā)現(xiàn) 顯著雜蛋白。測定酶活性用MAPADA UV 1600PC分光光度計(jì)和Biotek ELX 800酶標(biāo)儀。其余 未注明的試劑及材料來自阿拉丁、上海生工或者北京鼎國生物等國內(nèi)公司。
[0028] 應(yīng)用實(shí)施例1:篩選適合高通量裂解誘導(dǎo)表達(dá)PAAS后大腸桿菌細(xì)胞的表面活性劑
[0029] 1.取轉(zhuǎn)化PAAS表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)，用250ml TB培養(yǎng)基在1L培養(yǎng) 瓶中37°C放大培養(yǎng)4小時(shí);加 IPTG到1. OmM在16°C誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)；
[0030] 2.2000rpm離心20分鐘收集細(xì)胞；用50mM Tris-HCl pH 8.0的緩沖液洗滌細(xì)胞一 次;再用此緩沖液懸浮到20ml，超聲裂解30min;得到PAAS的樣品；
[0031] 3.將候選表面活性劑用前述50mM Tris-HCl pH 8.0的緩沖液稀釋到10%，并進(jìn)一