一種用于dna分子多位點(diǎn)突變的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于DNA分子多位點(diǎn)突變的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在蛋白工程領(lǐng)域，定向進(jìn)化技術(shù)是一種可以加速目的蛋白進(jìn)化成帶有特定性狀蛋 白的有力工具。在蛋白定向進(jìn)化的整個(gè)流程中，蛋白突變體庫(kù)的構(gòu)建是很重要的一環(huán)，突 變體庫(kù)的大小、偏好性直接關(guān)系著定向進(jìn)化技術(shù)的效率和得到目的蛋白的可能性。突變體 庫(kù)構(gòu)建最常規(guī)的辦法是通過(guò)error-prone PCR或者DNA shuffling來(lái)完成，然后將此突變 體庫(kù)插入到蛋白表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。雖然error-prone PCR和 DNA shuffling本身可以生成一個(gè)非常大的突變體庫(kù)（長(zhǎng)度為lkb，總量為lug的DNA雙鏈 約含1012個(gè)DNA分子），但是通常在經(jīng)過(guò)亞克隆（突變體庫(kù)插入蛋白表達(dá)載體）這一步后， 突變效率會(huì)大為降低（通常只能得到1〇 3-1〇6個(gè)突變體），這種低效率產(chǎn)生的原因包括：載 體和插入片段酶切的效率低、連接效率低以及載體自連現(xiàn)象。除此之外，亞克隆這一步通常 需要兩個(gè)限制性內(nèi)切酶，而每個(gè)限制性內(nèi)切酶在突變體片段及載體上都只能有一個(gè)酶切位 點(diǎn)，因此這大大限制了可用的限制性內(nèi)切酶的種類。
[0003] 針對(duì)這些局限性，Maynard等人提出了一種不需要限制性內(nèi)切酶來(lái)進(jìn)行突變體 庫(kù)構(gòu)建的方法，他們使用很多大引物、T7聚合酶、T4DNA連接酶以及一個(gè)特殊的感受態(tài)細(xì) 胞dut +ung+E. coli來(lái)完成，但是因?yàn)閐ut+ung+菌株很難獲得，并且此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法比 較繁瑣，因此并不是一個(gè)很好的方法。另一個(gè)用于突變體庫(kù)構(gòu)建的方法是全質(zhì)粒的大引 物PCR(MegaWHOP)，是QuikChange單位點(diǎn)突變的衍生方法。但是，這種方法需要大量的 (l-2ng/ul)來(lái)源于dam +菌株中的質(zhì)粒做模板，并且需要大量的dpnl酶來(lái)完全消化模板。 除此之外，MegaWHOP方法的轉(zhuǎn)化效率約為10 4-105個(gè)突變體/lug DNA，轉(zhuǎn)化效率也不是很理 想。
[0004] 在此情況下，Zhang等人研發(fā)出了一種基于PCR技術(shù)的不需要限制性內(nèi)切酶以及 連接酶的突變體庫(kù)構(gòu)建方法。這種方法主要包括三步：一，通過(guò)高保真性PCR反應(yīng)來(lái)合成 需要的DNA片段；二，通過(guò)prolonged overlap extension PCR來(lái)合成DNA多聚體；三，將 DNA多聚體轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞中。這種方法的問(wèn)題在于轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率比較低。而之 后為了提高這種方法在大腸桿菌宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率并且使這個(gè)方法更加適用于突變體 庫(kù)的構(gòu)建，他們?cè)诤铣蒁NA多聚體后用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并且用T4DNA聚合酶進(jìn)行連 接。但是，這樣依然無(wú)法擺脫對(duì)于酶的依賴，而且這種方法獲得的突變體庫(kù)有部分出現(xiàn)序列 混亂的情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于DNA分子多位點(diǎn)突變的方法。
[0006] 本發(fā)明提供了用于DNA分子多位點(diǎn)突變的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)針對(duì)DNA分子中p個(gè)待突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成q個(gè)引物對(duì)，q小于等于p ;p和q均 為大于等于1的整數(shù)；根據(jù)所述P個(gè)待突變位點(diǎn)在所述DNA分子的位置，順次將q個(gè)引物對(duì) 分別編號(hào)為Ι-q ;
[0008] 每個(gè)所述引物對(duì)由互為反向互補(bǔ)序列的上游引物和下游引物組成，其中所述上游 引物包含突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的突變后核苷酸；所述引物對(duì)中每條引物的大小均為30_40nt ;
[0009] 2)將q個(gè)所述引物對(duì)中的每個(gè)引物對(duì)的上游或下游引物與其相鄰的引物對(duì)的下 游或上游引物作為組合引物對(duì)，分別對(duì)所述DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同的擴(kuò)增片段； 所述每個(gè)組合引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增片段與其相鄰的組合引物對(duì)對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增片段均具有互補(bǔ) 配對(duì)區(qū)域；
[0010] 3)將所有的所述擴(kuò)增片段進(jìn)行overlap PCR反應(yīng)，獲得突變的DNA分子。
[0011] 上述上游引物包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于二者之間一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn) 對(duì)應(yīng)的核苷酸，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均大于或等于10bp。
[0012] 上述方法中，所述DNA分子為環(huán)狀的DNA分子。
[0013] 上述方法中，
[0014] 步驟2)包括如下步驟：用引物對(duì)1的上游引物1和引物對(duì)2的下游引物2,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到片段1，用所述引物對(duì)2的上游引物2和引物對(duì)3的下游引物3,進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到片段2,依次推導(dǎo)，用引物對(duì)q-Ι的上游引物q-Ι和引物對(duì)q的下游引物q進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到片段q_l，用所述引物對(duì)q的上游引物q和所述引物對(duì)1的下游引物1進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到片段q。
[0015] 上述方法中，
[0016] 步驟3)包括如下步驟：將步驟2)中所述片段1至所述片段q的全部片段加入不 含有引物的over 1 ap PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)，再向加入q個(gè)所述引物對(duì)中的任一個(gè)，繼續(xù)反 應(yīng)，得到含有突變位點(diǎn)的環(huán)狀DNA分子，實(shí)現(xiàn)環(huán)狀DNA分子多位點(diǎn)突變。
[0017] 上述方法中，
[0018] 所述DNA分子為線狀DNA分子。
[0019] 上述方法中，
[0020] 步驟1)還包括：設(shè)計(jì)引物X0和引物XP的步驟；
[0021] 所述引物X0的靶序列位于引物對(duì)1靶序列的上游，且所述引物X0與引物對(duì)1上 游引物的延伸方向一致；；
[0022] 所述引物XP的靶序列位于引物對(duì)q靶序列的下游，且所述引物XP的延伸方向與 所述引物對(duì)q下游引物的延伸方向一致；
[0023] 步驟2)包括如下步驟：用所述引物對(duì)1的上游引物1和引物對(duì)2的下游引物2,進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到片段1，用所述引物對(duì)2的上游引物2和引物對(duì)3的下游引物3,進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到片段2,依次推導(dǎo)，用引物對(duì)q-Ι的上游引物q-Ι和引物對(duì)q的下游引物q進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到片段q_l，用所述引物對(duì)q的上游引物q和所述引物Xp進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 片段q，用所述引物X0與所述引物對(duì)1的下游引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段q+Ι ;
[0024] 步驟3)包括如下步驟：將所述片段1至所述片段q+1的全部片段加入不含有引物 的overlap PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)，再加入所述引物X0和所述引物Xp，繼續(xù)反應(yīng)，得到含有突 變位點(diǎn)的線狀DNA分子，實(shí)現(xiàn)線狀DNA分子多位點(diǎn)突變。
[0025] 上述方法中，
[0026] 步驟2)包括如下步驟：用引物對(duì)1的上游引物1和引物對(duì)2的下游引物2,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到片段1，用引物對(duì)2的上游引物2和引物對(duì)3的下游引物3,進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到片段2,依次推導(dǎo)，用引物對(duì)q-Ι的上游引物q-Ι和引物對(duì)q的下游引物q進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到片段q _l ;
[0027] 步驟3)包括如下步驟：將所述片段1至所述片段q-Ι的全部片段加入不含有引物 的overlap PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)，再加入所述引物對(duì)q的下游引物q和所述引物對(duì)1的上 游引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繼續(xù)反應(yīng)，得到含有突變位點(diǎn)的環(huán)狀DNA分子，實(shí)現(xiàn)線狀DNA分子 多位點(diǎn)突變。
[0028] 上述方法中，
[0029] 步驟3)中，所述再加入引物的時(shí)間為待所述反應(yīng)至第7-8個(gè)循環(huán)時(shí)。
[0030] 上述方法中，
[0031] 所述待突變位點(diǎn)為所述DNA分子編碼的氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼子或所述DNA分子的核 苷酸。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述的氨基酸密碼子為兼并密碼子或者非簡(jiǎn)并密碼子。
[0034] 上述方法中，
[0035] 所述DNA分子為環(huán)狀DNA分子；
[0036] 所述p個(gè)待突變位點(diǎn)為3個(gè)待突變核苷酸位點(diǎn)，且所述q個(gè)引物對(duì)為2個(gè)引物對(duì)；
[0037] 或所述p個(gè)待突變位點(diǎn)為12個(gè)待突變核苷酸位點(diǎn)，且所述q個(gè)引物對(duì)為3個(gè)引物 對(duì)；
[0038] 所述3個(gè)待突變核苷酸位點(diǎn)為所述環(huán)狀DNA分子核苷酸序列第2184位C、第4673 位的G和第4674位的C，所述環(huán)狀DNA分子核苷酸序列第2184位C所在的氨基酸為所述環(huán) 狀DNA分子編碼氨基酸中的第10位，所述第4673位的G和第4674位的C所在的氨基酸為 所述環(huán)狀DNA分子編碼氨基酸中的第840位氨基酸；
[0039] 所述2個(gè)引物對(duì)為引物對(duì)1和引物對(duì)2 ;
[0040] 所述引物對(duì)1由序列表中序列3所示的上游引物1和序列表中序列4所示的下游 引物1組成；
[0041] 所述引物對(duì)2由序列表中序列5所示的上游引物2和序列表中序列6所示的下游 引物2組成；
[0042] 所述環(huán)狀DNA分子為質(zhì)粒PSBlA2-dCas9,其核苷酸序列為序列表中序列2 ;
[0043] 所述含有突變堿基的環(huán)狀DNA分子核苷酸序列為序列表中序列1。
[0044] 所述12個(gè)待