高。根據(jù)這兩個基因 兩側(cè)的核苷酸序列，分別設(shè)計基因特異引物，并用來檢測桃資源品種，發(fā)現(xiàn)PpendoPGF基因 與桃果實離核性狀完全共分離，PpendoPGM基因與桃果實溶質(zhì)性狀完全共分離，從而明確了 PpendoPGF和PpendoPGM基因就是分別控制離核和溶質(zhì)性狀的關(guān)鍵基因（圖1、圖2)。
[0023] 2、在F-M位點設(shè)計了37對染色體步移引物，逐步擴(kuò)增并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定 PpendoPGF和PpendoPGM基因在粘核溶質(zhì)以及粘核不溶質(zhì)桃品種F-M位點上的初始位置和大 小。在預(yù)估測缺失片段的兩端分別設(shè)計特異引物，用來擴(kuò)增缺失后的核苷酸序列，通過測序 明確缺失片段的大小和序列信息。即在粘核溶質(zhì)桃品種中，F(xiàn) - Μ位點缺失一段包含 PpendoPGF基因在內(nèi)的大小為12.8Kb的核苷酸序列；而在粘核不溶質(zhì)桃品種中，F(xiàn)-M位點缺 失了包含PpendoPGF和PpendoPGM基因在內(nèi)的大小為70.5Kb的核苷酸序列（圖3)。
[0024] 根據(jù)缺失片段兩端核苷酸序列，開發(fā)分別與兩個缺失片段共分離的分子標(biāo)記 (WBG-P38和WBG-P39)，并用來檢測桃資源品種。結(jié)果為WBG-P38和WBG-P39標(biāo)記分別與粘核 溶質(zhì)和粘核不溶質(zhì)性狀緊密關(guān)聯(lián)，分型結(jié)果能直接對應(yīng)果實的這兩種表型（圖4)。
[0025] 3、根據(jù)上述標(biāo)記分型結(jié)果和果實品質(zhì)性狀對應(yīng)的相互關(guān)系，應(yīng)用這些標(biāo)記，在桃 幼苗期對其基因型進(jìn)行檢測，進(jìn)而推斷其成熟結(jié)果后的果實表型；或?qū)Τ墒焯覙溥M(jìn)行基因 分型檢測，根據(jù)其基因型和預(yù)期表型篩選適合用于雜交育種的種質(zhì)資源作為父母親本。 [0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果：
[0027] 1、本發(fā)明結(jié)合桃基因組和RNA-Seq測序結(jié)果，首次明確了 F-M位點控制桃果實離核 性狀的PpendoPGF基因，該基因與F-M位點控制桃果實軟化性狀的PpendoPGM基因緊密連鎖， 且同源性超過99%。已經(jīng)在更廣泛的種質(zhì)資源群體中驗證了這兩個基因的連鎖標(biāo)記，結(jié)果 均證明標(biāo)記的有效性，以及基因鑒別結(jié)果的正確性。
[0028] 2、本發(fā)明針對控制桃果實離核和溶質(zhì)性狀的PpendoPGF和PpendoPGM基因以及它 們?nèi)笔У暮塑账嵝蛄虚_發(fā)了 4個緊密連鎖的分子標(biāo)記，鑒于桃的童期相對較長，利用這4個 標(biāo)記可在幼苗期明確植株的離核和溶質(zhì)特征，將顯著縮短育種的相關(guān)周期。并且這些標(biāo)記 也可用于篩選合適的雜交親本，能夠區(qū)分雜合的親本，鑒別隱性的基因型，結(jié)果準(zhǔn)確可靠， 達(dá)到以前育種所使用的方法無法企及的效果，從而顯著提高育種的效率。
【附圖說明】
[0029] 圖1是控制桃果實離核(A)和溶質(zhì)(B)性狀候選基因排列圖；
[0030] 圖 2 是PpendoPGF(ppa006857m)(A)和 PpendoPGM(ppa006839m)(B)基因與桃果實離 核和軟化性狀關(guān)聯(lián)性分析圖；
[0031] 圖3是F-M位點的PpendoPGF和PpendoPGM基因在離核溶質(zhì)(A)、粘核溶質(zhì)(B)和粘核 不溶質(zhì)(C)桃品種的多態(tài)性分布圖；
[0032] 圖4是兩個缺失分子標(biāo)記WBG-P8 (A)和WBG-P39 (B)在桃資源品種中的分布圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結(jié)合附圖和實施例詳細(xì)說明：
[0034]實施例1:分子標(biāo)記的分型檢測
[0035] 取50-100mg的桃葉片用于蘋果基因組DNA提取，桃基因組DNA提取利用植物基因組 DNA提取試劑盒(天耕）。分子標(biāo)記PCR反應(yīng)采用10yL的反應(yīng)體系，如下：40μΜ dNTPs 0.5yL， 10XPCR Buffer Ι.ΟμL,ΙΟμΜ Primer Pair 0.5yL,rTaq 0. lyL,ddH2〇5.4yL,DNA(20ng/y L)2 · 5yL。反應(yīng)程序為：95°C，5min; [95°C，30s; 60°C，30s; 72°C，3min]35個循環(huán)；最后72°C延 伸lOmin。
[0036] 表1用于分子標(biāo)記基因分型的引物列表
[0037]
[0038] 表2桃資源品種離核和溶質(zhì)性狀特征調(diào)查
[0039]
[0040]
[0041] 序列表
【主權(quán)項】
1. 一種控制桃果實離核和軟化性狀的基因，其特征在于： ① 控制桃果實離核性狀基因PpendoPGF:基因序列如SEQIDN0.1所示，基因編碼的蛋 白序列如SEQIDNO.2所示； ② 控制桃果實軟化性狀基因PpendoPGM:基因序列如SEQIDNO.3所示，基因編碼的蛋 白序列如SEQIDNO.4所示。2. 按權(quán)利要求1所述一種控制桃果實離核和軟化性狀的基因的應(yīng)用，其特征在于： ① 通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法在桃育種的早期借助這兩個基因的分型篩選雜交后 代植株的離核和軟化性狀； ② 借助這兩個基因在桃品種中的分型篩選合適的桃品種作為雜交親本，在雜交后代中 定向選育桃果實離核和軟化性狀。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種調(diào)控桃果實離核和軟化性狀的基因及其應(yīng)用，涉及果樹分子遺傳育種領(lǐng)域。根據(jù)前人遺傳定位結(jié)果和桃基因組序列分離出桃4號染色體末端調(diào)控桃果實離核性狀的PpendoPGF基因和果肉溶質(zhì)性狀的PpendoPGM基因，它們均編碼內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，根據(jù)這兩個基因和它們的兩端序列、以及檢測到的序列缺失情況開發(fā)了4個基于特異引物擴(kuò)增片段的分子標(biāo)記。采用這4個標(biāo)記對群體進(jìn)行基因分型，根據(jù)每個標(biāo)記與桃果實離核和溶質(zhì)性狀的相關(guān)性，可在幼苗期即篩選雜交后代植株果實的離核和軟化性狀。同時該基因分型鑒定有利于篩選合適的桃栽培品種親本植株進(jìn)行雜交授粉，以達(dá)到定向育種的目的。本發(fā)明是分子標(biāo)記輔助選擇在桃遺傳育種中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N9/26, C12N15/56, C12Q1/68
【公開號】CN105441465
【申請?zhí)枴緾N201511000523
【發(fā)明人】韓月彭, 谷超, 王魯, 廖燎, 鄧顯豹, 汪魏
【申請人】中國科學(xué)院武漢植物園
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月25日