用于治療高胱氨酸尿癥的胱硫醚β-合酶的制作方法
【專利說明】用于治療高胱氨酸尿癥的胱硫醚β-合酶
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 本申請(qǐng)要求保護(hù)2013年1月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/758,138和2013年3月14日 提交的美國(guó)非臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?3/803，804的權(quán)益，其各自的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總體上涉及適于酶替代療法的組合物，其包含人胱硫醚β-合酶(CBS)形式， 其可以顯著地降低血清高半胱氨酸(Hey)濃度和增加下游代謝物例如胱硫醚和半胱氨酸的 產(chǎn)生。這樣的組合物可用于治療病況或疾病例如高胱氨酸尿癥和高半胱氨酸再次甲基化障 礙。
[0003] 發(fā)明背景 CBS，在轉(zhuǎn)硫作用途徑中的一種重要的酶，在真核生物的高半胱氨酸(Hey)代謝中起重 要作用（Mudd等人，2001，載于THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE,第8版，第 2007-2056 頁(yè)，McGraw-Hill, New York) <XBS酶催化絲氨酸和高半胱 氨酸的吡哆醛-5 磷酸(PLP;維生素 B6)-依賴性縮合以形成胱硫醚，該胱硫醚隨后用于通 過另一種PLP-依賴性酶(胱硫醚γ-裂解酶)產(chǎn)生半胱氨酸。當(dāng)CBS活性急劇降低或不存在 時(shí)，作為某些基因突變的結(jié)果，Hey在組織和血液中構(gòu)建。在具有轉(zhuǎn)硫作用途徑的哺乳動(dòng)物 細(xì)胞中，CBS在Hey再甲基化為甲硫氨酸或其在半胱氨酸的生物合成中的備選用途之間占據(jù) 了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)位置。
[0004]在健康的正常個(gè)體中，CBS介導(dǎo)的從Hey到胱硫醚的轉(zhuǎn)化為從甲硫氨酸(Met)代謝 成半胱氨酸(Cys)的限速中間步驟。維生素 B6為此過程的必需輔酶。在CBS酶中具有某些基 因突變的個(gè)體中，從Hey到胱硫醚的轉(zhuǎn)化變慢或缺失，導(dǎo)致酶底物(Hey)的血清濃度升高以 及在酶產(chǎn)物(胱硫醚;Cth)的血清濃度相應(yīng)降低。升高的Hey血清水平及其并發(fā)的向尿中的 排泄的臨床病況，統(tǒng)稱為高胱氨酸尿癥。
[0005]對(duì)于高胱氨酸尿癥的患病率的估計(jì)差異很大。新生兒篩查和臨床確認(rèn)的數(shù)據(jù)提供 1:200，000-1:335，000活產(chǎn)的范圍(Mudd等人，2001)。來自丹麥、德國(guó)、挪威和捷克共和國(guó) 的新生兒DNA篩查研究的近期證據(jù)顯示真實(shí)發(fā)病率可能高達(dá)~1:6,000 (Gaustadnes等人， 1999，N Engl J Med. 1340:1513;Linnebank等人，2001，Thromb Haemost. 85:986; Refsum等人，2004，Clin. Chem. 50:3;Sokolova等人，2001，Hum Mutat. 18:548)。另 外，近期工作已經(jīng)指示CBS-缺陷型高胱氨酸尿癥(CBSDH)個(gè)體具有精神病學(xué)的或心血管的 并發(fā)癥，但目前未經(jīng)診斷，因?yàn)槿狈Φ湫偷赜兄谠\斷的特征性結(jié)締組織缺陷（Li和 Stewart, 1999，Pathol. 31:221 ;Linnebank等人，2003，J. Inherited Metabol. Dis. 26: 509;Maclean等人，2002，Hum Mutat. 19:641)。與CBSDH相關(guān)的主要健康問題包括： 具有易于血栓形成傾向的心血管疾病，導(dǎo)致未經(jīng)治療和經(jīng)部分治療的患者中的高死亡率； 以進(jìn)行性近視和晶狀體異位影響視覺系統(tǒng)的結(jié)締組織問題;影響骨骼的結(jié)締組織問題，其 特征為馬方綜合征、骨質(zhì)疏松癥和脊柱側(cè)凸；以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)問題，其包括智力遲鈍和癲 癇。
[0006] CBS相關(guān)的高胱氨酸尿癥的治療解決方法取決于CBS基因中存在的突變類型。迄今 為止在人類中已經(jīng)鑒定出CBS基因的大約160種致病性突變。與CBSDH相關(guān)的致病性突變的 性質(zhì)中有功能性三分法(functional trichotomy)。一組突變被歸類為"吡咳醇-響應(yīng)的"， 其中CBS酶功能可以被高劑量維生素 B6治療恢復(fù)。該治療可以是有效的，但在這些個(gè)體中并 非總能減輕病理事件，在這些個(gè)體中一些事件甚至隨時(shí)間而發(fā)生。第二組功能突變以"C-末 端CBS突變體"為代表，其缺乏響應(yīng)由S-腺苷甲硫氨酸所致的翻譯后上調(diào)的能力。具有這類 突變的個(gè)體通常缺乏智力遲鈍和結(jié)締組織方面的表型。在40歲之前的特發(fā)性血栓形成事件 后檢測(cè)血漿Hey水平后檢測(cè)到這類突變(Maclean等人，2002，Hum Mutat.19: 641-55)。最 后一組CBSDH突變是"傳統(tǒng)的高胱氨酸尿癥"，代表該病的最嚴(yán)重的形式。對(duì)于這后兩組個(gè) 體，單獨(dú)的維生素 B6治療不能有效降低血清Hey水平。
[0007] 純合的CBS缺乏的病理生理學(xué)無疑是復(fù)雜的，但有這樣的共識(shí):終末器官損傷的根 本誘因（instigator)就是血清Hey極度升高。在Hey的血液和組織濃度上的極大升高的毒性 可因 Hey本身的分子反應(yīng)性和生物效應(yīng)而產(chǎn)生，或者可因其影響大量生物過程的代謝物(例 如Hey-硫代內(nèi)酯）而產(chǎn)生(Jakubowski等，2008，F(xiàn)ASEB J 22: 4071-6)。慢性血小板聚集的 異常、血管參數(shù)的改變以及內(nèi)皮機(jī)能障礙均已在患有高胱氨酸尿癥的個(gè)體中描述。
[0008] 目前對(duì)于CBSDH的治療存在三種治療選項(xiàng)： 1) 在維生素 B6響應(yīng)的患者中使用藥理學(xué)劑量的維生素 B6來增加 CBS活性的殘余活性； 2) 通過嚴(yán)格限制Met攝入的飲食來降低血清Hey;和 3) 通過甜菜堿介導(dǎo)的將Hey轉(zhuǎn)化成Me t來解毒，從而降低血清Hey濃度。
[0009] 這3種療法各自的目的在于降低血清Hey濃度。對(duì)于受維生素 B6無響應(yīng)的CBSDH所 累的個(gè)體的標(biāo)準(zhǔn)治療由補(bǔ)充以代謝配方和Cys(其在此情況下已成為條件必需氨基酸）的 Met-限制飲食組成。肉、乳制品以及富含天然蛋白質(zhì)的其它食物的攝入被禁止。需要每日消 耗難吃的含氨基酸和微量營(yíng)養(yǎng)物的合成代謝配方，以防止繼發(fā)性營(yíng)養(yǎng)不良。補(bǔ)充甜菜堿(商 品名：CYSTADANE?，同義詞：三甲基甘氨酸）亦是標(biāo)準(zhǔn)療法。甜菜堿充當(dāng)用于在肝中通過甜 菜堿-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化的將Hey再甲基化成Met的甲基供體(Wi leken等，1983，N. Engl. J. Med. 309: 448-53)。即便在提供最佳護(hù)理和資源的醫(yī)療中心中，飲食遵從性通 常亦很差，并且這種非遵從性主要牽涉到高胱氨酸尿癥的威脅生命的并發(fā)癥的發(fā)展。
[0010] 以上部分所述的證據(jù)概述為以下要點(diǎn)： ?未經(jīng)治療的高胱氨酸尿癥在血管、結(jié)締組織和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有高的并發(fā)癥率。
[0011] *降低血清Hey的治療，例如嚴(yán)格Met限制飲食和甜菜堿，如果執(zhí)行良好的話，減少 相關(guān)臨床問題。認(rèn)知表現(xiàn)上的改善需要在嬰兒早期開始治療。
[0012] *對(duì)飲食的遵從性一律很差。在新生兒期開始治療的個(gè)體中，遵從性的減少發(fā)生 在青春期。在新生兒期之后開始治療的個(gè)體中，遵從性在所有年齡段都很差。目前治療方法 的極端困難在經(jīng)歷可通過飲食預(yù)防的威脅生命的癥狀、但仍然不能堅(jiān)持該治療的個(gè)體中是 很顯然的。
[0013] *飲食遵從性的失敗導(dǎo)致血清Hey增加，血管和結(jié)締組織的并發(fā)癥包括致命和失 能事件再現(xiàn)，并冒著嚴(yán)重副反應(yīng)例如腦水腫（由于過度血清Met濃度)或嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良（由于 缺乏必需氨基酸）的風(fēng)險(xiǎn)。
[0014] *最有效的治療策略是增加酶活性，當(dāng)將吡哆醇給予維生素 B6響應(yīng)的高胱氨酸尿 癥時(shí)是明顯的。該策略對(duì)維生素 B6非響應(yīng)的個(gè)體是無能為力的，因?yàn)檫@些個(gè)體中的突變狀 態(tài)和增加的酶活性將取決于外源酶的遞送，即酶替代療法(ERT)(從未企圖治療高胱氨酸 尿癥的一項(xiàng)策略）。
[0015] *在這三種現(xiàn)有治療策略中具有已證明的功效：（1)在維生素 B6響應(yīng)的個(gè)體中用 吡哆醇增加酶活性；（2)通過Met限制飲食減少累積代謝物;和(3)在甜菜堿治療中通過甜 菜堿-高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活性的解毒，所有都共同減低血漿中的總Hey (Walter， 等人，1998，Eur J Pediatr 157(Suppl 2): S71-6)〇
[0016] 另外，對(duì)于用于人類患者的所有現(xiàn)有治療策略(除了 B6補(bǔ)充，其僅適合一部分高胱 氨酸尿癥），高半胱氨酸的減少并不伴隨Cth或Cys的增加。因?yàn)樯形创_定過量Hey(而不是缺 乏下游代謝物)是臨床癥狀的原因，因此限制在減少高半胱氨酸的現(xiàn)有治療對(duì)于提供穩(wěn)健 和有效治療選項(xiàng)而言可能是不適當(dāng)?shù)摹?br>[0017] 因此，本領(lǐng)域仍然需要對(duì)于高胱氨酸尿癥的個(gè)體的更有效的治療策略。
[0018] 發(fā)明概述 如本文所述，本發(fā)明提供用于尤其在高胱氨酸尿癥的個(gè)體中降低血清Hey的組合物、尤 其是組合物、和方法。也提供的是組合物、尤其是藥物組合物，其恢復(fù)基本正常的代謝物水 平，所述代謝物包括但不限于甲硫氨酸，例如半胱氨酸和胱硫醚。如本文中更具體描述的那 樣，提供了用于高胱氨酸尿癥的酶替代療法(ERT)的試劑和方法，其中已對(duì)天然酶的修飾形 式進(jìn)行重組工程改造，通過尤其提供改善的穩(wěn)定性、活性和體內(nèi)藥物效用，以改善其藥用可 接受性。
[0019] 在第一方面，本發(fā)明提供包含SEQ ID N0: 02的分離的CBS多肽，其中所述分離的 CBS多肽包含化學(xué)修飾并且是全長(zhǎng)人CBS蛋白在氨基端、羧基端或在其氨基端和羧基端這兩 端經(jīng)遺傳工程改造的截短物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人CBS的工程改造變體，其構(gòu) 成C-末端調(diào)節(jié)區(qū)已被除去的重組人CBS (例如，rhCBSAC -該rhCBSAC在羧基端具有截短 的138殘基并包含全長(zhǎng)蛋白的551個(gè)氨基酸的氨基酸1-413) (SEQ ID N0: 3)。在某些實(shí)施 方案中，該種rhCBS △ C是突變的，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短的突變CBS是rhCBS Δ C-C15S (或縮寫為"C15S" -該C15S在羧基端具有截短的138殘基;與rhCBSAC相同）（SEQ ID NO: 13)，其中CBS氨基酸序列的位置15的半胱氨酸殘基變?yōu)榻z氨酸。在具體的實(shí)施方案中 本文公開的包括已經(jīng)化學(xué)修飾的、尤其是通過與C-末端截短的重組人CBS (尤其是rhCBS Δ C)的聚乙二醇(PEG)部分共價(jià)連接的截短的重組人CBS種類。這些聚乙二醇化的種類分別稱 為PEG-rhCBS Δ C或PEG-C15S。這些組合物(修飾的重組酶)和使用方法、尤其是如本文給出 的治療用途，使得高胱氨酸尿癥的個(gè)體可享受少得多的限制飲食(例如每日攝取2 g或更多 的蛋白質(zhì)/kg)，并具有顯著降低的Hey血漿水平和基本正常的代謝物水平(包括但不限于甲 硫氨酸，例如半胱氨酸和胱硫醚），導(dǎo)致長(zhǎng)期的臨床改善。
[0020] 有利的是，本發(fā)明使個(gè)體能達(dá)到對(duì)血清Hey水平的良好控制，而不用極端限制飲 食，后者具有不可接受的不遵從率。使用所述截短的種類，尤其是突變種類，尤其是所述 C15S突變體(聚乙二醇化的或同時(shí)突變和聚乙二醇化的）可有利地伴隨個(gè)體的改善的代謝， 并因此改善臨床結(jié)果，這體現(xiàn)在尤其與顯著降低的血清Hey濃度相關(guān)的發(fā)病率和死亡率降 低。
[0021] 如本文公開的，C15S突變的人CBS種類有利地采用了這樣的結(jié)構(gòu):其顯著增加了在 體內(nèi)的藥物利用(例如，無可檢測(cè)的聚集水平）X15S突變的人CBS種類也表現(xiàn)出高度可重現(xiàn) 的表達(dá)、純化和聚乙二醇化模式，并且C15S突變減少了聚集的形成，因此通過改進(jìn)回收而改 善了收率，并且能夠更一致和可重現(xiàn)的聚乙二醇化。這些方面也可用于質(zhì)量問題，這對(duì)于在 體內(nèi)應(yīng)用之前的步驟特別相關(guān)。
[0022]如本文公開的，相比非聚乙二醇化的截短變體、尤其是所述rhCBSAC或C15S種類， 聚乙二醇化的種類有利地具有增加的大小，其中聚乙二醇化的種類有減少的或延遲的清 除。另外，用PEG的化學(xué)修飾掩蔽了蛋白質(zhì)表面上的潛在的免疫原性表位和阻礙了蛋白水解 酶接近該蛋白質(zhì)。聚乙二醇化也有利地改變了rhCBS Δ C蛋白的理化性質(zhì)，因此改變了其生 物分布、穩(wěn)定性和溶解度，而不顯著地?fù)p失其效力。
[0023] 根據(jù)以下發(fā)明詳述和所附權(quán)利要求書，將會(huì)更充分地理解本發(fā)明的這些和其它特 征和優(yōu)勢(shì)。注意，權(quán)利要求書的范圍受到其中的詳述限定，而不受本描述中給出的特征和優(yōu) 勢(shì)的具體論述限定。
[0024] 本發(fā)明的附圖簡(jiǎn)述 當(dāng)結(jié)合下列附圖閱讀時(shí)，可最好地理解本發(fā)明的實(shí)施方案的下列詳述。
[0025]圖1闡明了在rhCBS Δ C聚乙二醇化后，血漿酶在體內(nèi)的保留時(shí)間增加的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 圖1提供了在單次給予rhCBS △ C和聚乙二醇化的rhCBS △ C后的藥代動(dòng)力學(xué)概況及其在體內(nèi) 的穩(wěn)定性的證據(jù)。圖la是顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，其中經(jīng)由腹膜內(nèi)（IP)、血管內(nèi)（IV)或皮下 (SQ)途徑給C57BL/6J小鼠注射5 mg/kg體重的人截短CBS (rhCBS Δ C)。將兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組(稱為 1和2)的各5只小鼠用于每種注射途徑(總共n=30)。對(duì)于每種注射途徑，在注射后0、1、8和24 小時(shí)從組1采血，在注射后1、4、10和48小時(shí)從組2采血。用放射活性測(cè)定法(如實(shí)施例1所述） 分析血漿的CBS活性。圖lb是在CBS從循環(huán)中清除后，如圖la所述的每組的2只代表性小鼠血 漿中的CBS的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果的照片。CBS在12%凝膠上的SDS-PAGE分離和蛋白質(zhì)印跡 到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，將膜用兔多克隆抗hCBS抗體探測(cè)，然后用綴合到辣根過氧化 物酶的第二抗兔抗體探測(cè)，然后條帶用SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce目錄 號(hào)34077)顯色。圖lc是顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的柱狀圖，其中經(jīng)由SQ途徑給小鼠注射5 mg/kg體重的 ME020MA-或GL4-400MA-聚乙二醇化的rhCBS Δ C或非聚乙二醇化的rhCBS Δ CJE020MA代表 用ME020MA聚乙二醇化的rhCBS Δ C酶，GL4-400MA代表用GL4-