制備抗人乳頭瘤病毒抗原的t細(xì)胞的方法
【專利說明】制備抗人乳頭瘤病毒抗原的τ細(xì)胞的方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求于2013年7月15日提交的美國臨時(shí)專利申請第61 /846，161號的權(quán) 益，所述臨時(shí)專利申請通過引用整體并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] -些癌癥類型，例如宮頸癌的主要原因是人乳頭瘤病毒(HPV)感染。盡管在諸如化 療的治療中取得進(jìn)展，但包括HPV相關(guān)癌癥在內(nèi)的許多癌癥的預(yù)后可能很差。因此，存在對 癌癥，特別是HPV相關(guān)癌癥的其他治療的未得到滿足的需求。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明的實(shí)施方案提供了制備HPV特異性Τ細(xì)胞群的方法，所述方法包括:將HPV陽 性腫瘤樣品分成多個(gè)碎塊;在僅存在一種細(xì)胞因子的情況下分別培養(yǎng)多個(gè)碎塊;從培養(yǎng)的 多個(gè)碎塊中獲得τ細(xì)胞;檢測用于特異性自體HPV陽性腫瘤識別和HPV抗原識別中的一種或 兩種的Τ細(xì)胞;選擇顯示出特異性自體HPV陽性腫瘤識別和HPV抗原識別中的一種或兩種的Τ 細(xì)胞;以及擴(kuò)增所選擇的Τ細(xì)胞數(shù)目以產(chǎn)生HPV特異性Τ細(xì)胞群。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了制備HPV特異性Τ細(xì)胞群的方法，該方法包括:將 HPV陽性腫瘤樣品分成多個(gè)碎塊;分別培養(yǎng)多個(gè)碎塊;從培養(yǎng)的多個(gè)碎塊中獲得Τ細(xì)胞;檢測 用于特異性自體HPV陽性腫瘤識別和HPV抗原識別中的一種或兩種的Τ細(xì)胞;選擇顯示出特 異性自體HPV陽性腫瘤識別和HPV抗原識別中的一種或兩種的Τ細(xì)胞；以及采用（i )0ΚΤ3抗體 和(ii)白細(xì)胞介素（IL)_2中的一種或兩種擴(kuò)增所選擇的Τ細(xì)胞數(shù)目以產(chǎn)生HPV特異性Τ細(xì)胞 群。
[0008] 本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供了治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，該方法包 括:將HPV陽性腫瘤樣品分成多個(gè)碎塊;分別培養(yǎng)多個(gè)碎塊;從培養(yǎng)的多個(gè)碎塊中獲得T細(xì) 胞;檢測用于特異性自體HPV陽性腫瘤識別和HPV抗原識別中的一種或兩種的T細(xì)胞;選擇顯 示出特異性自體HPV陽性腫瘤識別和HPV抗原識別中的一種或兩種的T細(xì)胞;擴(kuò)增所選擇的T 細(xì)胞數(shù)目以產(chǎn)生用于過繼性細(xì)胞療法的HPV特異性T細(xì)胞群；以及以有效治療或預(yù)防哺乳動(dòng) 物中的癌癥的量向哺乳動(dòng)物施用擴(kuò)增數(shù)目的T細(xì)胞。
[0009] 附圖簡述
[0010] 圖1A是顯示在與靶標(biāo)gplOO肽庫(有陰影的柱)或HPV 18E7肽庫(無陰影的柱)共培 養(yǎng)后，由1號患者的22個(gè)腫瘤碎塊(F1-F22)產(chǎn)生的效應(yīng)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)或黑色素 瘤TIL分泌的干擾素 -γ (IFN-γ )(pg/mL)的圖。
[0011] 圖1B是顯示在與靶自體腫瘤細(xì)胞系（無陰影的柱）或624細(xì)胞（黑色素瘤細(xì)胞系） (有陰影的柱)共培養(yǎng)后，效應(yīng)黑色素瘤TIL或由1號患者的22個(gè)腫瘤碎塊(F1-F22)產(chǎn)生的 TIL分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。
[0012] 圖2A是顯示在與靶自體腫瘤細(xì)胞（有陰影的柱）、自體組織的外周血單核細(xì)胞 (PBMC)(有正斜線陰影的柱），與所有I類基因座匹配的腫瘤細(xì)胞(有反斜線陰影的柱），HLA 不匹配的HeLa細(xì)胞(有縱條紋的柱)或HLA不匹配的CaSki細(xì)胞(有橫條紋的柱)共培養(yǎng)后，由 1號患者的F16、F17或F22腫瘤碎塊產(chǎn)生的效應(yīng)TIL，或給予患者用于治療的細(xì)胞（"輸液袋"） 分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。
[0013] 圖2B是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)(無腫瘤)或與用針對HLA-A、HLA-B、HLA-C的沉默RNA或針 對不相關(guān)靶標(biāo)的RNA(非靶向）的自體腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，由1號患者的效應(yīng)TIL分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。
[0014]圖2C是顯示在無抗體(黑色柱）、有抗HLA-A2抗體(有反斜線陰影的柱)或抗II類抗 體(有正斜線陰影的柱）的情況下，在與靶細(xì)胞（效應(yīng)/靶細(xì)胞：1號患者的TIL/自體腫瘤細(xì) 胞;DMF5/624細(xì)胞;或F15/HPV18E6m-135)共培養(yǎng)后，由效應(yīng)TIL分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。 白色柱表示單獨(dú)培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞。
[0015]圖3是顯示在與gplOO肽庫（白色柱）、0KT3抗體(有橫條紋的柱)或用HPV 18E7肽庫 (黑色柱）、HPV 18Ε7肽庫和W6/32(有細(xì)的正斜線陰影的柱）、HPV 16Ε7η-19(有粗的正斜線陰 影的柱）、HPV 16Ε7η-19和16/32(有方格的柱）、HPV 16Ε7η-19和冊145(有垂直交叉的柱）、 HPV 18E6m -135(有反斜線陰影的柱）、HPV 18E6m -135和W6/32(有交叉的柱）或HPV 18E6m-135和HB 145(有白色勾勒黑色長方形的柱)脈沖刺激的樹突細(xì)胞(DC)共培養(yǎng)后，由1 號患者的F16或F22腫瘤碎塊的效應(yīng)TIL;給予患者用于治療的細(xì)胞（"輸液袋"）；黑色素瘤 TIL1、2或3(從黑色素瘤腫瘤培養(yǎng)的TIL);mE7TCR(經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)針對HPV 16E7n-的T 細(xì)胞）；或F15TIL(來自另一名患者的TIL，其對HPV 18E6m-135具有反應(yīng)性，為II類限制性 的，因此可以用HB145封閉）分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。
[0016] 圖4A和4B是顯示在與gplOO肽庫(灰色柱)或HPV 18E7肽庫（黑色柱)共培養(yǎng)后，由1 號患者的F16腫瘤碎塊克隆的效應(yīng)TIL的1 -24號克隆(A)或24-48號克?。˙)分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。
[0017] 圖5是顯示在與用HPV 18E6肽庫（黑色柱）、HPV 18E7肽庫（灰色柱）或gplOO肽庫 (對照)脈沖刺激的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，由12號患者的36個(gè)不同的腫瘤碎塊(F1-F36)或黑色 素瘤TIL(DM5)(對照)分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。
[0018] 圖6是顯示在與用編碼綠色熒光蛋白（GFP)(白色柱)或HPV 18E6(灰色柱）的慢病 毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC或用gplOO肽庫(有正斜線陰影的柱)或HPV 18E6肽庫(有反斜線陰影的柱） 脈沖刺激的DC共培養(yǎng)后，由12號患者的F1腫瘤碎塊或黑色素瘤TIL1、2或3產(chǎn)生的效應(yīng)TIL分 泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。有橫條紋的柱表示與0KT3抗體培養(yǎng)的TIL。
[0019] 圖7A是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)(灰色柱)或與HPV18E6肽庫（黑色柱)共培養(yǎng)后，1、3、12和 20號克隆分泌的腫瘤壞死因子(TNF)a( Pg/mL)的圖。
[0020] 圖7B是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)（白色柱）或與HPV18E6肽庫（灰色柱）或HPV18E6肽子庫1 (有正斜線陰影的柱）、子庫2(有反斜線陰影的柱）、子庫3(有橫條紋的柱）、子庫4(有縱條紋 的柱)或子庫5(黑色柱)共培養(yǎng)后，3、12和20號克隆分泌的TNFa(pg/mL)的圖。
[0021 ]圖7C是顯示在單獨(dú)培養(yǎng)（白色柱)或與HPV18E6的30號肽(有點(diǎn)狀的柱）、31號肽（黑 色柱）、32號肽(灰色柱）、33號肽(有縱條紋的柱）、34號肽(有正斜線陰影的柱）、35號肽(有 反斜線陰影的柱）、36號肽(有方型的柱)或37號肽(有交叉縫式的柱)共培養(yǎng)后，3、12和20號 克隆分泌的TNFa(pg/mL)的圖。
[0022] 圖8六-8(：是顯示在與自體?81(：(?12)或來自供體1-6之一的?8如共培養(yǎng)后，3以）、12 (B)和20號(C)克隆分泌的TNFa(pg/mL)的圖。
[0023]圖9A是顯示在與用HPV 18E677-9i(無陰影的柱）或HPV 18E6m-135肽(有陰影的柱） 脈沖刺激的自體 PBMC(P12)或 DRB1*15、DQB1*06 供體 PBMC、DRB1*15 供體 PBMC 或 DQB1*06 供體 PBMC共培養(yǎng)后，12號患者的F15腫瘤碎塊的3號克隆分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。
[0024] 圖9B是顯示在具有針對HLA-DR(有橫條紋的柱）、HLA-DQ(有反斜線陰影的柱）、 HLA-DP(有正斜線陰影的柱)的抗體、泛I類抗體(黑色柱)或泛II類抗體（白色柱）的情況下， 在與用HPV 18E6m-135肽沖刺激的PBMC或與624細(xì)胞共培養(yǎng)的mF5T細(xì)胞(經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)抗 MART-1的TCR)共培養(yǎng)后，12號患者的F15腫瘤碎塊的20號克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。
[0025] 圖10是顯示在與用HPV 16E6肽庫(有反斜線陰影的柱）、HPV 16E7肽庫(有正斜線 陰影的柱）或gpl〇〇肽庫（對照）（黑色條)脈沖刺激的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，來自4號患者的24 個(gè)不同的腫瘤碎塊(F1-F24)的效應(yīng)TIL或黑色素瘤TIL(對照）分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。 星號(*)表示τ IL輸注入患者。
[0026]圖11A是顯示在與用HPV 16E7肽庫(有陰影的柱)或不用肽(無陰影的柱)脈沖刺激 的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，來自4號患者的CD8陽性效應(yīng)TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。 [0027]圖11B是顯示在與用HPV 16E7肽庫(有陰影的柱)或不用肽(無陰影的柱)脈沖刺激 的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，來自4號患者的CD4陽性效應(yīng)TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。 [0028]圖11C是顯示在與用HPV 16E6肽庫(有陰影的柱)或不用肽(無陰影的柱)脈沖刺激 的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，來自4號患者的CD8陽性效應(yīng)TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。 [0029]圖11D是顯示在與用HPV 16E6肽庫(有陰影的柱)或不用肽(無陰影的柱)脈沖刺激 的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，來自4號患者的CD4陽性效應(yīng)TIL克隆分泌的IFN-γ (pg/mL)的圖。
[0030] 圖12A-B是用過繼性細(xì)胞療法治療前(A)和治療后九個(gè)月（B)的4號患者胸部的計(jì) 算機(jī)斷層掃描(CT)。A中的箭頭指向腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)中的癌性病灶。
[0031] 圖12C-D是用過繼性細(xì)胞療法治療前（C)和治療后九個(gè)月（D)的4號患者胸部的CT 掃描。C中的箭頭指向左肺門淋巴結(jié)中的癌性病灶。
[0032] 圖12E-F是用過繼性細(xì)胞療法治療前(E)和治療后九個(gè)月（F)的4號患者骨盆的CT 掃描。E中的箭頭指向髂總淋巴結(jié)中的癌性病灶。
[0033]圖13是顯示在與用HPV 18E6肽庫(有反斜線陰影的柱）、HPV 18E7肽庫(有正斜線 陰影的柱）或gpl〇〇肽庫（對照）（黑色柱)脈沖刺激的樹突細(xì)胞共培養(yǎng)后，來自8號患者的24 個(gè)不同的腫瘤碎塊的效應(yīng)ΤIL或黑色素瘤ΤIL (對照)分泌的IFN- γ (pg/mL)的圖。星號(*)表 示TIL輸注入患者。
[0034]圖14A-B是用過繼性細(xì)胞療法治療前(A)和治療后兩個(gè)月（B)的8號患者肝臟的磁 共振成像(MRI)掃描。A中的箭頭指向癌性肝部腫塊。
[0035]圖14C-D是用過繼性細(xì)胞療法治療前（C)和治療后兩個(gè)月（D)的8號患者腹部的CT 掃描。C中的箭頭指向腹膜后淋巴結(jié)中的癌性病灶。
[0036] 圖14E-F是用過繼性細(xì)胞療法治療前(E)和治療后兩個(gè)月（F)的8號患者腹部的CT 掃描。E中的箭頭指向癌性腹壁腫塊。
[0037] 圖14G-H是用過繼性細(xì)胞療法治療前(G)和治療后兩個(gè)月（H)的8號患者骨盆的CT 掃描。G中的箭頭指向癌性左結(jié)腸周腫塊。
[0038]圖15A是顯示在HPV-TIL輸注后各時(shí)間點(diǎn)（月數(shù)）的4號患者的腹主動(dòng)脈旁（圓形）、 左門（正方形）、右門（Δ)和髂總（▽)的腫瘤尺寸測量值(從基線的變化％)的圖。
[0039]圖15B是顯示在HPV-TIL輸注后各時(shí)間點(diǎn)（月數(shù)）的8號患者的腹壁（圓形）、腹主動(dòng) 脈旁(正方形）、左骨盆（A )和右輸尿管(▽)的腫瘤尺寸測量值(從基線的變化％)的圖。
[0040] 圖16A-D是8號患者延遲釓增強(qiáng)的T1加權(quán)MRI圖像。A和C各自顯示治療前肝表面的 腫瘤。B和D顯示治療后11個(gè)月均無腫瘤。A和C中的箭頭指示腫瘤的位置。
[0041] 圖17A是治療后各時(shí)間點(diǎn)（天數(shù)）測量的4號患者血清細(xì)胞因子水平(pg/ml)的圖。 測量的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素（IL)_2(實(shí)心圓）、IL-4(正方形）JL-6(A) JL-13(T)、粒 細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)(菱形）和腫瘤壞死因子a(TNF-a)(空心圓）。施用于患者的細(xì)胞 因子標(biāo)有下劃線。
[0042] 圖17B是治療后各天測量的8號患者的血清細(xì)胞因子水平(pg/ml)的圖。測量的細(xì) 胞因子包括IL-2(實(shí)心圓）、IL-5(實(shí)心正方形）、11^6(贏）、11^8(^)、6-05?(菱形）、單核細(xì) 胞趨化蛋白-1 (MCP)-1 (空心圓）和TNF-a(空心正方形）。施用于患者的細(xì)胞因子標(biāo)有下劃 線。
[0043] 圖18A-D是顯示待施用于4號患者(A和C)或8號患者(B和D)的TIL針對HPV E6(有陰 影的柱）、HPV E7(有陰影的柱）或愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)(對照）的反應(yīng)性的圖，如通過 IFN- γ的分泌(pg/ml) (A和B)和ELI SPOT分析(C和D)測定。無陰影的柱代表來自同一名患者 的EBV反應(yīng)性的T細(xì)胞的反應(yīng)性(對照）。
[0044]圖19A-B是顯示在輸注TIL后不同時(shí)間點(diǎn)（天數(shù)）時(shí)的4號